Ngoài phân tích mô bệnh học, kiểm tra ký sinh trùng và phân lập vi khuẩn từ các mẫu tôm bệnh, kỹ thuật PCR và RT-PCR cũng đã được sử dụng để xem xét mức độ cảm nhiễm của virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) và virus gây ra hội chứng Taura (TSV) bởi đã có nhiều thông báo về tác hại của 2 loại virus này trên tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) và một trong các dấu hiệu của 2 hội chứng bệnh này đó là sự chuyển màu đỏ của 1 phần (TS) [32, 42, 25, 54] hay toàn bộ cơ thể ở tôm bị bệnh (WSS) [11, 15, 20, 42, 55, 83]. Phương pháp và địa điểm phân tích mẫu tôm đã được trình bày ở phần 2-phần phương pháp nghiên cứu. Mức độ nhiễm WSSV và TSV được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5.Kết quả phân tích PCR để phát hiện WSSV và RT-PCR để phát hiện TSV và mô bệnh học các mẫu tôm chân trắng bị hội chứng chết đỏ tại Khánh Hòa.
PCR và RT-PCR
Stt Nguồn gốc mẫu tôm bệnh
WSSV TSV Mô bệnh học Mẫu tôm đỏ thân, có đốm trắng trên cơ thể (6 mẫu)
1 Ninh an-Ninh Hòa + - (+) WSSV
2 Viện nuôi CR-A1 + - (+) WSSV
3 Viện nuôi CR- A4 + - (+) WSSV
4 Viện nuôi CR- A5 + - (+) WSSV
5 A.Thành-Cam Lập-Cam Ranh + - (+) WSSV
6 A.Dũng-Cam Lập-CR + - (+) WSSV
Mẫu tôm đỏ thân nhưng không có đốm trắng trên cơ thể (12 mẫu)
7 Viện nuôi CR-A2* - - (+) WSSV
8 Viện nuôi CR-A3 + - (+) WSSV
9 C. Thanh-Cam Lập-CRanh + - (+) WSSV
11 A.Phương- Cam Lập-CR* - - (+) WSSV
12 Mỹ Thanh-Cam Ranh + - (+) WSSV
13 A. Chính-Mỹ thanh-CR* - - (-) WSSV
14 Cam Đức-Cam Lâm + (+) WSSV
15 A.Hương-Cam Thành Bắc- CR + (+) WSSV
16 Đầm Môn-Vạn Ninh + (+) WSSV
17 Cam Lập-Cam Ranh + (+) WSSV
18 Vạn Ninh + (+) WSSV
Kết quả ở bảng 3.5 đã cho thấy, một tỷ lệ cảm nhiễm rất cao của WSSV ở các mẫu tôm bị hội chứng chết đỏ (15/18), chiếm 83,3% khi phân tích bằng kỹ thuật Nested-PCR, dù mẫu tôm đó chỉ xuất hiện đỏ thân hay kết hợp giữa chết đỏ thân và đốm trắng. Từ kết quả phân tích bằng kỹ thuật PCR này cũng đã cho thấy tỷ lệ nhiễm WSSV khá phù hợp với kết quả phân tích mô bệnh học của các mẫu tôm này. Các biến đổi trong mô và tế bào của tôm chân trắng bệnh đặc trưng cho hiện tượng nhiễm WSSV đã được mô tả bởi nhiều tác giả: Lightner (1996), Durand (1997), Wang (1999), Rodriguez (2003), Bortolini-Rosales (2003), Afsharnasab (2009), OIE (2009) [42, 20, 83, 66, 15, 11, 55]. Tuy nhiên, có 3/18 mẫu (*) bị nhiễm hội chứng chết đỏ có kết quả âm tính với WSSV bằng kỹ thuật PCR, chiếm 16,7% và trong đó chỉ có 1 mẫu có kết quả âm tính trùng hợp với phân tích mô bệnh học (mẫu số 13). Còn 2 mẫu còn lại (7 và 11) đều bộc lộ đặc điểm mô bệnh học dương tính với WSSV, nhưng lại có kết quả ngược lại khi phân tích bằng PCR, đặc biệt ở mẫu số 7. Do đó, kỹ thuật PCR đã được chạy lại lần 2 cho 2 mẫu này nhưng kết quả vẫn không thay đổi. Rất khó để giải thích thuyết phục được điều này bởi vì kỹ thuật nested-PCR rất nhạy trong chẩn đoán WSSV, tuy nhiên chúng tôi cho rằng, có thể do số lượng tôm của một mẫu tôm bệnh đưa vào phân tích PCR còn ít (5 con/mẫu). Hoặc khi đàn tôm mới phát bệnh với các dấu hiệu chuyển màu đỏ của thân tôm, người nuôi đã nhanh chóng thu hoạch để giảm bớt tổn thất, nên rất có thể những con tôm chưa nhiễm hoặc mới chỉ nhiễm ở mức độ rất nhẹ đã được thu. Mặt khác cũng không loại trừ lý do từ thao tác trong cố định và lưu giữ mẫu tôm bệnh trong cồn ethanol 95% cho kỹ thuật PCR, vì chất cố định này rất dễ bay hơi làm giảm nồng độ cồn và gây hỏng mẫu và cũng có thể loại cồn ethanol
dùng để cố định các mẫu tôm bệnh này được sản xuất ở Việt Nam, do đó có thể có các tạp chất có trong cồn đã làm ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Có 13 trong số 18 mẫu tôm bệnh được kiểm tra bằng kỹ thuật RT-PCR theo phương pháp đã được hướng dẫn của OIE (2009) để phát hiện tỷ lệ cảm nhiễm virus TSV ở các mẫu tôm chân trắng bị hội chứng chết đỏ. Từ kết quả ở bảng 3.5 cũng đã cho thấy, không có mẫu tôm nào trong số 13 mẫu tôm bị chết đỏ có kết quả dương tính với TSV, mặc dù các mẫu tôm đưa vào xét nghiệm RT-PCR đều thể hiện mầu hồng đỏ và chết rất nhanh. Kết quả này cũng phù hợp với đặc điểm đã quan sát được trên các tiêu bản mô bệnh học của tôm bệnh, các biến đổi bệnh lý đặc thù của hội chứng Taura (TS) đã không phát hiện được trên bất kỳ mẫu tôm bệnh nào được kiểm tra bằng phương pháp mô bệnh học.
Kết hợp các kết quả phân tích bằng kỹ thuật PCR, RT-PCR, phân lập vi khuẩn và quan sát các biến đổi bệnh lý ở các các tiêu bản mô bệnh học như đã trình bày ở các
Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm PCR (WSSV) bằng gel agarose 1,2% của các mẫu tôm chân trắng bị hội chứng chết đỏ nuôi tại Khánh Hòa.
M: thang DNA (100 bp); Mẫu 1: chứng dương WSSV ở 221 bp.
Mẫu 5: chứng âm WSSV ở 195 bp; IC: chứng nội tại.
Mẫu 2,3,4,7,8,9,10: dương tính WSSV ở 221 bp, IC (+), tương ứng với các mẫu
tôm chân trắng thu tại Ninh An, Viện Nuôi-A1, Mỹ Thanh, A. Thành-Cam Lập, Cam Đức, A. Dũng-Cam Lập, Vạn Ninh.
Mẫu 6,11,12:âm tính với WSSV ở 195 bp, IC (+), mẫu thu tại Viện Nuôi-A2, A. Chính-Cam Lập, A. Phương-Cam Lập.
mục 3.2, 3.3 và 3.4 có thể nhận định rằng, hội chứng chết đỏ thân của tôm chân trắng trong các ao nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa có liên quan nhiều tới virus WSSV.