5. Những đóng góp mới của luận án
2.3. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 1 năm 2009 đến tháng 12 năm 2013 2.4. Nội dung nghiên cứu
- Xác định biotype rầy nâu tại Thừa Thiên Huế
- Đánh giá khả năng kháng rầy nâu và xác định gen kháng của các giống lúa đang sử dụng phổ biến và các giống lúa mới, nhập nội có triển vọng ở Thừa Thiên Huế.
- Đánh giá sinh trưởng, phát triển, năng suất, phẩm chất và khả năng kháng rầy của một số giống tuyển chọn.
- Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật canh tác (mật độ, phân bón) đối với gống lúa kháng rầy nâu tại Thừa Thiên Huế.
40
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp xác định biotype rầy nâu
2.5.1.1. Phương pháp thu thập và duy trì giống chuẩn kháng và giống chuẩn nhiễm
- Các giống chuẩn kháng rầy nâu được cung cấp bởi Bộ môn Giống cây trồng, Khoa Nông nghiệp, Đại học Kyushu, Nhật Bản. Thu thập bổ sung các
giống chuẩn kháng và chuẩn nhiễm rầy nâu ở Viện Bảo vệ Thực vật.
- Gieo cấy các giống chuẩn nhiễm và chuẩn kháng trong chậu ở nhà lưới khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế và ngoài đồng ruộng tại Trung tâm nghiên cứu cây trồng Tứ Hạ, Viện nghiên cứu và Phát triển, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế (một lượng nhỏ hạt giống của các giống được bảo quản trong tủ lạnh tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật).
2.5.1.2. Phương pháp thu thập và nuôi rầy
- Phương pháp thu thập rầy: Thu thập rầy nâu trên các ruộng lúa ở Thừa Thiên Huế. Dùng ống hút thu rầy non và trưởng thành về phòng thí nghiệm. Thả rầy nâu vào lồng nuôi rầy có chứa hộp mạ (2 tuần tuổi) để tiếp tục nuôi quần thể rầy nâu. Hàng tháng thu thập rầy nâu ngoài đồng ruộng bổ sung vào lồng nuôi.
- Phương pháp nuôi rầy: Nhân nuôi quần thể rầy nâu bằng giống lúa TN1. Gieo hạt giống lúa vào trong khay nhựa (23cm × 18cm × 8cm). Sau mọc 10 - 15 ngày, cho khay mạ vào lồng nuôi rầy (45cm × 30cm × 25cm). Sau đó phóng thích rầy nâu thu thập được vào lồng. Đặt lồng nuôi rầy trong phòng thí nghiệm hoặc nhà lưới có đèn điện chiếu sáng. Tiến hành thay hộp mạ khác sau khi hộp mạ trong lồng nuôi rầy bị héo. Sau khi nuôi 4 - 5 thế hệ rầy, sử dụng rầy để tiến hành thí nghiệm đánh giá.
2.5.1.3. Phương pháp xác định Biotype rầy nâu
Đánh giá độc tính của rầy nâu đối với các giống chuẩn kháng theo phương pháp trong ống nghiệm của Tanaka và Matsumura, (2000) [131] và trong khay mạ của IRRI. Quần thể rầy nâu được phân thành 2 nhóm: Có độc tính và không có độc tính. Tỷ lệ cá thể có độc tính trong một quần thể rầy nâu cho biết mức độ độc của quần thể đó. Phân biệt rầy nâu cái có độc tính hay không dựa vào tỷ lệ sống sót và phần bụng của rầy cái. Phần bụng của rầy cái có độc tính thì thường to, căng phồng sau vũ hóa, trong khi đó phần bụng của rầy cái không có độc tính thì nhỏ và ngày càng gầy. Một vài rầy cái có thể xuất hiện trung gian giữa bụng to và nhỏ. Tuy nhiên độc tính của rầy nâu cái bụng nhỏ và trung bình được xác định bằng tỷ lệ sống sót trong vòng 5 ngày.
41
Gieo các giống lúa chuẩn kháng trong khay mạ. Sử dụng lúa 4 - 6 tuần tuổi để làm thí nghiệm. Cho 3 cây lúa vào 1 cốc có nước và đặt các cốc đó vào lồng nuôi sâu. Cho 10 rầy cái mới vũ hóa đến 24 giờ tuổi có bụng nhỏ, gầy vào lồng. Quan sát rầy cái từ ngày thứ 2 đến thứ 5. Đếm và bắt các rầy cái có bụng to, căng phồng ra khỏi lồng. Rầy cái có bụng căng phồng và sống sót sau 5 ngày là rầy có độc tính. Sử dụng 100 rầy cái cho 1 giống thí nghiệm.
Ngoài ra, sử dụng phương pháp của IRRI để đánh giá phản ứng của quần thể rầy nâu đối với giống kháng chuẩn. Gieo các giống lúa trên khay. Khi cây mạ được 2 lá (khoảng 7 ngày tuổi) nhổ mạ khỏi khay, dùng giấy thấm quấn dưới gốc. Sau đó cho 1 cây mạ vào ống nghiệm để qua 1 đêm rồi thả 03 rầy non tuổi 2 trên 1 cây mạ, Đầu ống nghiệm được che kín bằng vải mỏng. Hàng ngày quan sát hiện trạng cây mạ và số lượng rầy sống sót. Biểu hiện tác hại của rầy trên cây mạ và được phân cấp theo IRRI (Bảng 2.2 và Bảng 2.3).
Bảng 2.2. Bảng phân cấp hại và triệu chứng cây mạ bị hại
Cấp hại Tỷ lệ chết của rầy và triệu chứng cây mạ 0 ≥ 70% rầy chết, cây mạ khỏe
1 ≤ 70% rầy chết, cây mạ khỏe
3 Cây mạ bị biến vàng bộ phận (≤ 50%)
5 Hầu hết các bộ phận của cây bị biến vàng (> 50%) 7 Cây mạ đang héo
9 Cây mạ chết
Bảng 2.3. Bảng phân cấp hại và mức độ kháng rầy nâu
Cấp hại Mức độ kháng Cấp 0 - cấp 3 Kháng (K) Cấp 3,1 - cấp 4,5 Kháng vừa (KV) Cấp 4,6 - cấp 5,5 Nhiễm vừa (NV) Cấp 5,6 - cấp 7,0 Nhiễm (N) Cấp 7,1 - 9,0 Nhiễm nặng (NN)
Biotype của các quần thể rầy nâu được xác định dựa vào mức độ kháng và mối quan hệ giữa giữa gen kháng và các loại biotype của Khush và Brar (1991) và Zhang (2007) [61], [92].
42
2.5.2. Phương pháp đánh giá khả năng kháng rầy nâu ở Thừa Thiên Huế đối với các giống lúa nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và xác định gen đối với các giống lúa nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và xác định gen kháng đối với một số giống có biểu hiện kháng rầy nâu.
2.5.2.1. Phương pháp đánh giá tính kháng rầy nâu của các giống lúa trong phòng thí nghiệm phòng thí nghiệm
Đánh giá phản ứng của các giống lúa đối với quần thể rầy nâu bằng các phương pháp của IRRI: Đánh giá theo từng giống riêng lẻ trong ống nghiệm (không có sự lựa chọn thức ăn: non-choice test) và đánh giá chung cho tất cả các giống trong khay mạ (có sự lựa chọn thức ăn: choice test).
- Phương pháp trong ống nghiệm: Gieo các giống lúa trên khay, khi cây mạ được 2 lá (khoảng 7 ngày tuổi) nhổ mạ ra khỏi khay, dùng giấy thấm nước quấn dưới gốc. Sau đó đặt riêng lẻ cây mạ vào ống nghiệm (3cm x 20cm), để qua 1 đêm. Dùng ống hút thả 3 rầy non tuổi 2 vào một ống nghiệm. Đầu ống nghiệm được bọc bằng vải mỏng. Thí nghiệm tiến hành trên 61 giống lúa, nhắc lại 20 lần.
- Phương pháp trong hộp mạ: Gieo tất cả các giống lúa cần đánh giá vào chung một khay lớn (80cm x 15cm x 5cm). Một giống được gieo 10 cây thành một hàng theo chiều rộng của hộp. Đặt khay vào lồng nuôi rầy, giữ nước đủ ẩm cho cây lúa. Bảy ngày sau khi gieo, thả rầy nâu tuổi 2 (3 con/ cây lúa) vào trong khay bằng cách lấy những cây lúa bị hại nặng có mang rầy nâu từ lồng nuôi rầy nâu, vỗ nhẹ những cây này cho rầy rơi vào khay lúa. Thí nghiệm tiến hành trên 61 giống lúa, nhắc lại 5 lần.
Theo dõi chỉ tiêu cấp hại của cây mạ vào 5 và 7 ngày sau lây nhiễm (SLN). Kết quả đánh giá căn cứ vào bảng phân cấp hại theo triệu chứng của cây mạ và tỷ lệ rầy chết (đối với phương pháp trong ống nghiệm) và triệu chứng của cây mạ (đối với phương pháp trong khay mạ). Sau đó sử dụng bảng phân mức độ kháng của IRRI để xác định khả năng kháng rầy nâu của các giống lúa (Bảng
2.2; Bảng 2.3).
2.5.2.2. Phương pháp nhận diện sự có mặt của các gen kháng rầy nâu trong các giống lúa có biểu hiện kháng rầy nâu giống lúa có biểu hiện kháng rầy nâu
* Tách chiết DNA tổng số: Tách chiết DNA tổng số được thực hiện theo
phương pháp Kang và cs (2003) [58].
Lá mạ non (0,5-1 g) của cây lúa sau khi gieo 20 ngày, được nghiền thành bột mịn trong dung dịch nitơ lỏng, sau đó cho vào ống eppendorf (khoảng 2/3
43
thể tích ống). Bổ sung 500 µl đệm chiết DNA pH 7,5 (100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA) và 20% SDS vào mỗi ống eppendorf ở trên và ủ ở 650C trong 30 phút. Trong thời gian ủ, cứ 10 đến 15 phút lại lắc nhẹ một lần. Hết thời gian ủ ở 60°C, các ống chứa mẫu được lấy ra và thêm 500 µl dung dịch clorofoml:isoamyl (24:1). Lắc nhe trong 10 phút. Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau ly tâm, dùng pipethút lấy dịch trên cho sang ống eppendorf 1,5 ml mới rồi cho thêm thể tích isopropanol tương đương và lắc nhẹ. Sau khi ADN kết lại và nổi trong dung dịch, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để thu ADN và loại bỏ hết dịch trên. Rửa ADN bằng côn 75%. ADN được làm khô mẫu bằng máy cô chân không (Modul 3180C, BioTron). ADN được hòa tan với 20 µl nước cất vô trùng. Sau khi ADN được hòa tan, cho thêm 5 µl dung dịch Ribonuclease A để loại bỏ RNA, lắc nhẹ rồi ủ 30 phút ở 37°C. Dung dịch DNA tổng số được kiểm tra nồng độ trên máy quang phổ (SmartSpecTM3000, BioRad) ở bước sóng λ260/280 nm. Chất lượng DNA được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 0,8% ở 100V. Đệm điện di được sử dụng là 1x TAE (0,04 M Tris-acetate và 0,001 M EDTA). Nhuộm agarose gel 15 phút trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) (0,5 µg/L) và phân tích hình ảnh điện di bằng hệ thống Gel Documentation (BioRad).
* Thực hiện phản ứng PCR:
Sử dụng cặp mồi BpE18-3 (F:5′-CGCTGCGAGAGTGTGACACT-3′; R:5′-TTGGGTTACACGGGTTTGAC-3′) để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu bph1 ở các giống lúa nghiên cứu (Kim và cộng sự, 2005) [105]. Sử dụng cặp mồi KPM8 (F:5'- TAAATCCACCACACAAACAACG -3'; R:5'- AATTCCCACAAGGATTCGAACTCC -3') để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu Bph2 ở các giống lúa nghiên cứu (Sharma và cộng sự, 2004) [80].
Sử dụng cặp mồi RM 589 (F:5'- ATCATGGTCGGTGGCTTAAC-3'; R:5'- CAGGTTCCAACCAGACACTG -3') để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu bph3 ở các giống lúa nghiên cứu (McCouch và cộng sự, 2002) [69].
PCR được thực hiện trong tổng số 25 µL dung dịch phản ứng gồm 25 ng DNA tổng số, 1 µl mỗi loại mồi (mồi xuôi, mồi ngược), 12,5 1 µl Master mix (GoTaq® Green Master Mix 2x, Promega), 9,5 1 µl nước cất. Phản ứng khuếch đại DNA được tiến hành trong máy luân nhiệt (iCyler, BioRad) theo quy trình sau: 950C-5 phút; 30 chu kỳ: 950C -1 phút, 550C đến 600C -1 phút và 720C -1 phút; 720C -10 phút.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 1,5% ở 80V trong đệm 1xTAE. Nhuộm agarose gel 15 phút trong dung dịch Ethidium bromide (EtBr; 0,5 µg/mL) và quan sát hình ảnh điện di dưới ánh sáng tử ngoại bằng hệ thống Gel Documentation (BioRad).
44
2.5.3. Phương pháp đánh giá sinh trưởng, phát triển, năng suất, phẩm chất và khả năng kháng rầy nâu của một số giống tuyển chọn trên đồng ruộng khả năng kháng rầy nâu của một số giống tuyển chọn trên đồng ruộng
2.5.3.1. Phương pháp đánh giá tính kháng rầy nâu, tình hình sinh trưởng, phát triển và năng suất của các giống lúa có biểu hiện kháng rầy nâu trên đồng ruộng triển và năng suất của các giống lúa có biểu hiện kháng rầy nâu trên đồng ruộng
- Tiến hành khảo nghiệm trên đồng ruộng các giống lúa có biểu hiện kháng rầy từ kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, sử dụng giống lúa HT1 làm đối chứng (giống trồng phổ biến tại Thừa Thiên Huế). Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp khối hoàn toàn ngẫu nhiên (RCB), 3 lần lặp lại, diện tích mỗi ô thí nghiệm 20m2.
- Các biện pháp kỹ thuật áp dụng: Bón phân, chăm sóc áp dụng đồng đều và thích hợp theo quy trình kỹ thuật đang được áp dụng ở địa phương. Không sử dụng thuốc hóa học phòng trừ sâu bệnh.
- Thời vụ gieo: vụ Đông Xuân 2010 - 2011 và vụ Hè Thu 2011.
- Thí nghiệm được bố trí tại vùng đất phù sa cổ Hợp tác xã Hương An, thị xã Hương Trà và vùng đất cát ven biển Hợp tác xã Phú Đa 1, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế.
- Điều tra sâu hại: Theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng (QCVN 01 - 38:2010/BNNPTNT) [19], điều tra 5 điểm ngẫu nhiên trên hai đường chéo của mỗi ô. Điều tra định kỳ 7 ngày/lần, có điều tra bổ sung trước và trong đỉnh cao đỉnh xuất hiện dịch hại.
+ Điều tra rầy nâu: Đếm số lượng rầy trên 10 dảnh ngẫu nhiên trong
khung 40 x 50cm, sau đó tính mật độ rầy/m2 bằng cách lấy số lượng rầy trung bình trên 1 dảnh x số dảnh/m2.
+ Theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển, năng suất: Theo Quy
chuẩn kỹ thuật quốc gia về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng của giống lúa (QCVN 01 - 55:2011/BNNPTNT) [20].
+ Các chỉ tiêu theo dõi: Sức sống của mạ (điểm 1, 5, 9); Độ dài giai đoạn trổ
(điểm 1, 5, 9); Độ thuần đồng ruộng (điểm 1, 3, 5); Độ thoát cổ bông (điểm 1, 5, 9); Độ cứng cây (điểm 1, 5, 9); Độ tàn lá (điểm 1, 5, 9); Thời gian sinh trưởng (ngày); Chiều cao cây (cm); Độ rụng hạt (điểm 1, 5, 9); Số bông hữu hiệu (bông); Số hạt trên bông (hạt); Tỷ lệ hạt chắc (%); Khối lượng 1000 hạt (gam); Năng suất lý thuyết (tạ/ha); Năng suất thực thu (tạ/ha).
45 Sơ đồ bố trí thí nghiệm B ảo vệ Bảo vệ B ả o v ệ HP28 HT1 HP05 HP07 RNT07 HP01 HP29 HP10 HP19 HP10 HP19 RNT07 HP01 HT1 HP05 HP07 HP28 HP29 HP05 HP29 HP07 HP28 HP19 RNT07 HP01 HP10 HT1 Bảo vệ
2.5.3.2. Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu phẩm chất gạo của các giống lúa
* Chỉ tiêu về chất lượng gạo:
- Tỷ lệ gạo xay và gạo xay xát tính theo % khối lượng của thóc.
- Chiều dài hạt gạo: phân loại theo 10 TCN 558 - 2002. Bảng 2.4. Phân loại gạo dựa vào chiều dài hạt
Loại hạt Chiều dài hạt (mm)
Loại hạt rất ngắn < 4,50
Loại hạt ngắn 4,51 – 5,50
Loại hạt trung bình 5,51 – 6,50
Loại hạt dài 6,51 – 7,50
Loại hạt rất dài > 7,5
- Chiều rộng hạt gạo: Phân loại theo 10 TCN 558 - 2002. Bảng 2.5. Phân loại gạo dựa vào chiều rộng hạt
Loại hạt Chiều rộng hạt (mm)
Hẹp < 2,5
Trung bình 2,5 – 3,0
Rộng > 3,0
46
Bảng 2.6. Phân loại gạo dựa vào hình dạng hạt gạo theo tỷ lệ Dài/Rộng
Dạng hạt Dài/Rộng Tròn < 1,5 Bán tròn 1,5 – 1,99 Bán thon 2,0 – 2,49 Thon 2,5 – 2,99 Thon dài > 3,0
- Độ bạc bụng: Cho điểm theo 10 TCN 425 - 2000
Bảng 2.7. Phân loại gạo dựa vào độ bạc bụng của hạt
Thang điểm Mô tả Diện tích hạt bị
trắng bạc (%) 0 Hoàn toàn trong
(Không có vết bạc nào) 0 1 Hạt bạc rất nhỏ < 10 2 Hạt hơi bạc 10 – 20 3 Hạt bạc trung bình 21 – 35 4 Hạt bạc 36 – 50 5 Hạt rất bạc > 50
* Các chỉ tiêu sinh hóa:
- Xác định hàm lượng protein: Theo phương pháp Bradford.
+ Hạt lúa được bóc vỏ, sau đó được nghiền mịn thành bột trong cối sứ. + Cân 10 mg bột, bổ sung 300 µl đệm Hirata, vontex mẫu và ủ qua đêm ở 40C.
+ Ly tâm mẫu 15.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, loại bỏ kết tủa.
+ Lấy 4 µl dịch nổi bổ sung thêm 200 µl thuốc nhuộm Bradford 1X, trộn đều rồi đem đo ở bước sóng 595 nm trên máy quang phổ Biomate 3 của hãng Thermo. Mẫu trắng là đệm Hirata.
+ Dựng đường chuẩn theo kit của hãng BioRad với các thang nồng độ 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,34 mg/ml.
47
+ Hàm lượng protein được tính dựa trên đường chuẩn.
- Độ bền gel: Theo TCN 424 - 2000.
+ Hạt lúa được bóc vỏ, sau đó được nghiền mịn thành bột trong cối sứ. + Cân 100 mg bột cho vào ống nghiệm có kích thước (chiều cao × đường kính): 100×13 mm.
+ Bổ sung 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025% Thymol blue để cản trở sự vón cục do hồ hóa và tạo màu để dễ quan sát, trộn đều mẫu.
+ Bổ sung thêm 2 ml 0,2N KOH, trộn đều mẫu.
+ Ống nghiệm chứa mẫu được đun sôi trong 8 phút sau đó để nguội 5 phút ở nhiệt độ phòng, rồi làm lạnh trong nước đá 20 phút.
+ Đặt ống nghiệm nằm ngang trên mặt bàn cho gel chảy đều. Để gel đông sau 60 phút, tiến hành đo.
+ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
- Độ trở hồ: Theo TCNVN 5715:1993 [27].
Hạt lúa được bóc vỏ, sau đó cho vào mỗi đĩa petri nhựa 10 hạt và mỗi giống được tiến hành thí nghiệm trên 2 đĩa Petri nhựa. Bổ sung 10 ml KOH 1,7%, rồi dàn đều các hạt lúa trên bề mặt đĩa. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 23 giờ.