5. Những đóng góp mới của luận án
2.5.2.2. Phương pháp nhận diện sự có mặt của các gen kháng rầy nâu trong các
giống lúa có biểu hiện kháng rầy nâu
* Tách chiết DNA tổng số: Tách chiết DNA tổng số được thực hiện theo
phương pháp Kang và cs (2003) [58].
Lá mạ non (0,5-1 g) của cây lúa sau khi gieo 20 ngày, được nghiền thành bột mịn trong dung dịch nitơ lỏng, sau đó cho vào ống eppendorf (khoảng 2/3
43
thể tích ống). Bổ sung 500 µl đệm chiết DNA pH 7,5 (100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA) và 20% SDS vào mỗi ống eppendorf ở trên và ủ ở 650C trong 30 phút. Trong thời gian ủ, cứ 10 đến 15 phút lại lắc nhẹ một lần. Hết thời gian ủ ở 60°C, các ống chứa mẫu được lấy ra và thêm 500 µl dung dịch clorofoml:isoamyl (24:1). Lắc nhe trong 10 phút. Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau ly tâm, dùng pipethút lấy dịch trên cho sang ống eppendorf 1,5 ml mới rồi cho thêm thể tích isopropanol tương đương và lắc nhẹ. Sau khi ADN kết lại và nổi trong dung dịch, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để thu ADN và loại bỏ hết dịch trên. Rửa ADN bằng côn 75%. ADN được làm khô mẫu bằng máy cô chân không (Modul 3180C, BioTron). ADN được hòa tan với 20 µl nước cất vô trùng. Sau khi ADN được hòa tan, cho thêm 5 µl dung dịch Ribonuclease A để loại bỏ RNA, lắc nhẹ rồi ủ 30 phút ở 37°C. Dung dịch DNA tổng số được kiểm tra nồng độ trên máy quang phổ (SmartSpecTM3000, BioRad) ở bước sóng λ260/280 nm. Chất lượng DNA được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 0,8% ở 100V. Đệm điện di được sử dụng là 1x TAE (0,04 M Tris-acetate và 0,001 M EDTA). Nhuộm agarose gel 15 phút trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) (0,5 µg/L) và phân tích hình ảnh điện di bằng hệ thống Gel Documentation (BioRad).
* Thực hiện phản ứng PCR:
Sử dụng cặp mồi BpE18-3 (F:5′-CGCTGCGAGAGTGTGACACT-3′; R:5′-TTGGGTTACACGGGTTTGAC-3′) để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu bph1 ở các giống lúa nghiên cứu (Kim và cộng sự, 2005) [105]. Sử dụng cặp mồi KPM8 (F:5'- TAAATCCACCACACAAACAACG -3'; R:5'- AATTCCCACAAGGATTCGAACTCC -3') để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu Bph2 ở các giống lúa nghiên cứu (Sharma và cộng sự, 2004) [80].
Sử dụng cặp mồi RM 589 (F:5'- ATCATGGTCGGTGGCTTAAC-3'; R:5'- CAGGTTCCAACCAGACACTG -3') để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu bph3 ở các giống lúa nghiên cứu (McCouch và cộng sự, 2002) [69].
PCR được thực hiện trong tổng số 25 µL dung dịch phản ứng gồm 25 ng DNA tổng số, 1 µl mỗi loại mồi (mồi xuôi, mồi ngược), 12,5 1 µl Master mix (GoTaq® Green Master Mix 2x, Promega), 9,5 1 µl nước cất. Phản ứng khuếch đại DNA được tiến hành trong máy luân nhiệt (iCyler, BioRad) theo quy trình sau: 950C-5 phút; 30 chu kỳ: 950C -1 phút, 550C đến 600C -1 phút và 720C -1 phút; 720C -10 phút.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 1,5% ở 80V trong đệm 1xTAE. Nhuộm agarose gel 15 phút trong dung dịch Ethidium bromide (EtBr; 0,5 µg/mL) và quan sát hình ảnh điện di dưới ánh sáng tử ngoại bằng hệ thống Gel Documentation (BioRad).
44