5. Những đóng góp mới của luận án
1.5.2. Thay đổi tình hình dịch hại do gia tăng lượng phân đạm
Theo Lương Minh Châu và ctv (2006) [4]: “Hàm lượng đạm và lân trong lá lúa có tương quan thuận với bón phân đạm trong đất và không có tương quan với kali trong lá lúa”. Hàm lượng đạm tổng số trong lá lúa thì lại ảnh hưởng chính đến mức độ thiệt hại của các loại sâu hại lúa. Sharma và ctv (2004) đánh giá mức độ nhiễm bệnh theo các mức bón phân khác nhau tại Trung Quốc, Ấn Độ, Inddonessia, Philippines và Việt Nam cũng có kết luận rằng mức độ thiệt hại do bệnh khô vằn, lem lép hạt, sâu đục thân, sâu cuốn lá và chuột ở các công thức bón phân theo tập quán của nông dân đều cao hơn công thức bón phân theo vùng (SSNM). Một kết quả tương tự của Lương Minh Châu và ctv (2006) [4] đã chứng minh rằng trong ruộng lúa bón càng nhiều phân đạm thì mức độ thiệt hại do sâu, bệnh gây ra càng nặng, cụ thể là: rầy nâu, sâu đục thân, sâu cuốn lá, bệnh đạo ôn và bệnh vàng lá. Ruộng lúa bón đạm cao (200kg N/ha) bị rầy nâu gây hại ở mật độ cao, tỷ lệ thiệt hại do sâu cuốn lá, sâu đục thân và bệnh đạo ôn gia tăng. Tuy nhiên, cũng do mật độ sâu hại gia tăng ở ruộng bón đạm cao đã dẫn theo sự gia tăng mật độ quần thể của các loài thiên địch tự nhiên của các loài sâu hại này (nhện, bọ xít mù xanh) (Nguyễn Hữu Huân, 2006) [13].
Theo Sogawa (1982) [83]: “Sự bài tiết nước bọt của rầy nâu gia tăng theo hàm lượng đạm của lá lúa”. Theo Lu và ctv (2005) [68] ruộng lúa được bón thừa phân đạm cũng sẽ làm giảm khả năng ăn mồi của loài thiên địch tự nhiên của rầy
nâu, bọ xít mù xanh Cyrtorhinus lividipennis, bởi vì nước bọt của rầy nâu sống
trên cây lúa bón thừa đạm trong một thời gian dài sẽ làm thích nghi sinh thái của rầy nâu tăng cao hơn, khi đó nếu biện pháp phòng trừ sinh học trong tự nhiên bị phá vỡ thì gây nguy cơ bùng phát rầy nâu là rất lớn.
Gary và ctv (2005) [44] nghiên cứu về ảnh hưởng của các liều lượng phân
đạm bón cho lúa với loài rệp hại lúa Hysteroneura steriae đã rút ra kết luận rằng
hàm lượng đạm càng cao thì mức độ sống sót, khả năng sinh sản, chiều dài cá thể của loài rệp này lại càng tăng. Khi phân tích lá lúa ở các mức bón đạm khác nhau ông thấy rằng hàm lượng đạm bón có tương quan với chlorophyll, thành phần đạm và lân trong lá, không có tương quan với thành phần kali. Từ đó ông
37
giải thích rằng liều lượng bón đạm cao trên lúa làm gia tăng khả năng sống sót, sinh sản, kích thước cá thể, bùng phát, gây hại của rệp trên lúa là do ảnh hưởng đến chế độ thức ăn của rệp. Việc rệp bùng phát gây hại trên lúa tại các vùng khô hạn là do khô hạn làm thay đổi quá trình trao đổi chất của cây trồng làm cho protein bị phá hủy nhanh chóng, tạo ra dạng đạm dễ tiêu cho các loài chích hút sử dụng. Liều lượng đạm bón cho lúa cao góp phần làm gia tăng khả năng sống sót của rệp cũng có thể bằng cách can thiệp vào cơ chế tự bảo vệ của cây trồng (Gary và ctv, 2005) [44].
Tổng hợp các kết quả nghiên cứu trước đây về ảnh hưởng tương tác giữa ruộng lúa bón thừa đạm và dịch hại như sau: Nhiều loài côn trùng rút ngắn thời gian phát triển và gia tăng tốc độ tăng trưởng nhanh, làm tăng số lượng dịch hại, tỷ lệ sống sót, tính mắn đẻ, trọng lượng cơ thể và mức độ thiệt hại, càng tăng tỷ lệ sống sót của rầy cám, càng đẻ nhiều, nhất là khi nhiệt độ tăng và càng gia tăng mật độ trong giai đoạn đẻ nhánh đến làm đòng; càng thu hút nhiều bướm sâu cuốn lá đến cư trú và đẻ nhiều trứng.
Một số công trình nghiên cứu gần đây tại Trung Quốc về mối liên hệ giữa cây lúa giàu đạm với dịch hại, đặc biệt là rầy nâu cho thấy rằng: Khi hàm lượng đạm trong cây lúa gia tăng sẽ làm cho rầy cám sống sót nhiều hơn và rút ngắn vòng đời của chúng, rầy cái trưởng thành to hơn, đẻ nhiều trứng hơn và sống lâu hơn (Lu và ctv, 2005) [68]. Ruộng lúa được bón thừa đạm sẽ có tán che phủ dày, làm gia tăng hàm lượng amino acid trong dịch của cây lúa, cây lúa bị xốp, mọng nước sẽ kích thích rầy cái tìm đến hút nhựa và đẻ trứng; sâu non tuổi 1 của sâu đục thân vừa nở cũng dễ dàng đục vào thân lúa và di chuyển bên trong hệ thống mạch dẫn nhựa cây lúa. Ngoài ra, còn làm cho rầy nâu thay đổi vị trí cư trú và đẻ trứng. Ở cây lúa thừa đạm, rầy nâu sẽ di chuyển dần từ bên dưới gốc lên bẹ lá và lá cờ để đẻ trứng (Lu và ctv, 2005) [68].
38
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Rầy nâu: Quẩn thể rầy nâu thu thập trên ruộng lúa ở Thừa Thiên Huế.
- Giống lúa chuẩn kháng rầy nâu (giống chỉ thị): Mudgo (mang gen Bph1), ASD7 (bph2), Rathu Heenati (Bph3), PTB33 (bph2 và Bph 3), Babawee (bph4)... các giống chuẩn kháng này được cung cấp bởi khoa Nông nghiệp, Đại
học Kyushu, Nhật Bản; Giống lúa chuẩn nhiễm rầy nâu: TN1 (không có gen kháng rầy nâu) được cung cấp bởi Viện Bảo vệ thực vật; Giống lúa đang sử dụng phổ biến ở Thừa Thiên Huế và các tỉnh miền Trung; giống lúa mới; giống lúa nhập nội, cụ thể qua Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh mục các giống lúa sử dụng trong nghiên cứu
Loại giống Số lượng
Loài
phụ Nơi thu thập Ghi chú
Chuẩn kháng 05 Japonica
Nhật Bản; Viện Tài nguyên thực vật
Các giống mang gen
kháng Bph1, bph2, Bph3, bph4 (Mudgo,
ASD7, Rathu Heneeti, PTB33, Babawee). Chuẩn nhiễm 01 Indiaca Viện Bảo vệ thực
vật
TN1 (Taichung Native 1)
Giống nhập nội 27 Japonica Nhật Bản Các giống ký hiệu G
Giống mới
30 Indiaca IRRI
Chọn lọc bằng phương pháp chọn lọc quần thể phân ly từ giống nhập nội của IRRI
(IR86385, IR87936, IR83456) và được ký hiệu là HP.
02 Indiaca Quảng Nam RNT07, RNT03 Giống trồng phổ
39
- Loại đất: Đề tài được tiến hành nghiên cứu trên hai loại đất: đất phù sa cổ tại thị xã Hương Trà và đất cát ven biển huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế.
- Phân bón: + Phân vô cơ:
+ Phân đạm: Urê có hàm lượng đạm nguyên chất là 46%. + Phân lân: Phân Super photphat đơn có hàm lượng P2O5 là 16%. + Phân kali: Kali clorua có hàm lượng K2O là 50%.
+ Vôi bột: Hàm lượng CaO là 30%. + Phân hữu cơ: Phân chuồng hoai mục. - Mật độ gieo sạ
2.2. Địa điểm nghiên cứu
- Đối với các thí nghiệm trong phòng được thực hiện tại phòng thí nghiệm, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm Huế; Viện tài nguyên môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế.
- Đối với thí nghiệm ngoài đồng ruộng được thực hiện tại Hợp tác xã nông nghiệp Hương An, thị xã Hương Trà; Hợp tác xã nông nghiệp Phú Đa 1, xã Phú Đa, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế.
2.3. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 1 năm 2009 đến tháng 12 năm 2013 2.4. Nội dung nghiên cứu
- Xác định biotype rầy nâu tại Thừa Thiên Huế
- Đánh giá khả năng kháng rầy nâu và xác định gen kháng của các giống lúa đang sử dụng phổ biến và các giống lúa mới, nhập nội có triển vọng ở Thừa Thiên Huế.
- Đánh giá sinh trưởng, phát triển, năng suất, phẩm chất và khả năng kháng rầy của một số giống tuyển chọn.
- Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật canh tác (mật độ, phân bón) đối với gống lúa kháng rầy nâu tại Thừa Thiên Huế.
40
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp xác định biotype rầy nâu
2.5.1.1. Phương pháp thu thập và duy trì giống chuẩn kháng và giống chuẩn nhiễm
- Các giống chuẩn kháng rầy nâu được cung cấp bởi Bộ môn Giống cây trồng, Khoa Nông nghiệp, Đại học Kyushu, Nhật Bản. Thu thập bổ sung các
giống chuẩn kháng và chuẩn nhiễm rầy nâu ở Viện Bảo vệ Thực vật.
- Gieo cấy các giống chuẩn nhiễm và chuẩn kháng trong chậu ở nhà lưới khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế và ngoài đồng ruộng tại Trung tâm nghiên cứu cây trồng Tứ Hạ, Viện nghiên cứu và Phát triển, trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế (một lượng nhỏ hạt giống của các giống được bảo quản trong tủ lạnh tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật).
2.5.1.2. Phương pháp thu thập và nuôi rầy
- Phương pháp thu thập rầy: Thu thập rầy nâu trên các ruộng lúa ở Thừa Thiên Huế. Dùng ống hút thu rầy non và trưởng thành về phòng thí nghiệm. Thả rầy nâu vào lồng nuôi rầy có chứa hộp mạ (2 tuần tuổi) để tiếp tục nuôi quần thể rầy nâu. Hàng tháng thu thập rầy nâu ngoài đồng ruộng bổ sung vào lồng nuôi.
- Phương pháp nuôi rầy: Nhân nuôi quần thể rầy nâu bằng giống lúa TN1. Gieo hạt giống lúa vào trong khay nhựa (23cm × 18cm × 8cm). Sau mọc 10 - 15 ngày, cho khay mạ vào lồng nuôi rầy (45cm × 30cm × 25cm). Sau đó phóng thích rầy nâu thu thập được vào lồng. Đặt lồng nuôi rầy trong phòng thí nghiệm hoặc nhà lưới có đèn điện chiếu sáng. Tiến hành thay hộp mạ khác sau khi hộp mạ trong lồng nuôi rầy bị héo. Sau khi nuôi 4 - 5 thế hệ rầy, sử dụng rầy để tiến hành thí nghiệm đánh giá.
2.5.1.3. Phương pháp xác định Biotype rầy nâu
Đánh giá độc tính của rầy nâu đối với các giống chuẩn kháng theo phương pháp trong ống nghiệm của Tanaka và Matsumura, (2000) [131] và trong khay mạ của IRRI. Quần thể rầy nâu được phân thành 2 nhóm: Có độc tính và không có độc tính. Tỷ lệ cá thể có độc tính trong một quần thể rầy nâu cho biết mức độ độc của quần thể đó. Phân biệt rầy nâu cái có độc tính hay không dựa vào tỷ lệ sống sót và phần bụng của rầy cái. Phần bụng của rầy cái có độc tính thì thường to, căng phồng sau vũ hóa, trong khi đó phần bụng của rầy cái không có độc tính thì nhỏ và ngày càng gầy. Một vài rầy cái có thể xuất hiện trung gian giữa bụng to và nhỏ. Tuy nhiên độc tính của rầy nâu cái bụng nhỏ và trung bình được xác định bằng tỷ lệ sống sót trong vòng 5 ngày.
41
Gieo các giống lúa chuẩn kháng trong khay mạ. Sử dụng lúa 4 - 6 tuần tuổi để làm thí nghiệm. Cho 3 cây lúa vào 1 cốc có nước và đặt các cốc đó vào lồng nuôi sâu. Cho 10 rầy cái mới vũ hóa đến 24 giờ tuổi có bụng nhỏ, gầy vào lồng. Quan sát rầy cái từ ngày thứ 2 đến thứ 5. Đếm và bắt các rầy cái có bụng to, căng phồng ra khỏi lồng. Rầy cái có bụng căng phồng và sống sót sau 5 ngày là rầy có độc tính. Sử dụng 100 rầy cái cho 1 giống thí nghiệm.
Ngoài ra, sử dụng phương pháp của IRRI để đánh giá phản ứng của quần thể rầy nâu đối với giống kháng chuẩn. Gieo các giống lúa trên khay. Khi cây mạ được 2 lá (khoảng 7 ngày tuổi) nhổ mạ khỏi khay, dùng giấy thấm quấn dưới gốc. Sau đó cho 1 cây mạ vào ống nghiệm để qua 1 đêm rồi thả 03 rầy non tuổi 2 trên 1 cây mạ, Đầu ống nghiệm được che kín bằng vải mỏng. Hàng ngày quan sát hiện trạng cây mạ và số lượng rầy sống sót. Biểu hiện tác hại của rầy trên cây mạ và được phân cấp theo IRRI (Bảng 2.2 và Bảng 2.3).
Bảng 2.2. Bảng phân cấp hại và triệu chứng cây mạ bị hại
Cấp hại Tỷ lệ chết của rầy và triệu chứng cây mạ 0 ≥ 70% rầy chết, cây mạ khỏe
1 ≤ 70% rầy chết, cây mạ khỏe
3 Cây mạ bị biến vàng bộ phận (≤ 50%)
5 Hầu hết các bộ phận của cây bị biến vàng (> 50%) 7 Cây mạ đang héo
9 Cây mạ chết
Bảng 2.3. Bảng phân cấp hại và mức độ kháng rầy nâu
Cấp hại Mức độ kháng Cấp 0 - cấp 3 Kháng (K) Cấp 3,1 - cấp 4,5 Kháng vừa (KV) Cấp 4,6 - cấp 5,5 Nhiễm vừa (NV) Cấp 5,6 - cấp 7,0 Nhiễm (N) Cấp 7,1 - 9,0 Nhiễm nặng (NN)
Biotype của các quần thể rầy nâu được xác định dựa vào mức độ kháng và mối quan hệ giữa giữa gen kháng và các loại biotype của Khush và Brar (1991) và Zhang (2007) [61], [92].
42
2.5.2. Phương pháp đánh giá khả năng kháng rầy nâu ở Thừa Thiên Huế đối với các giống lúa nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và xác định gen đối với các giống lúa nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và xác định gen kháng đối với một số giống có biểu hiện kháng rầy nâu.
2.5.2.1. Phương pháp đánh giá tính kháng rầy nâu của các giống lúa trong phòng thí nghiệm phòng thí nghiệm
Đánh giá phản ứng của các giống lúa đối với quần thể rầy nâu bằng các phương pháp của IRRI: Đánh giá theo từng giống riêng lẻ trong ống nghiệm (không có sự lựa chọn thức ăn: non-choice test) và đánh giá chung cho tất cả các giống trong khay mạ (có sự lựa chọn thức ăn: choice test).
- Phương pháp trong ống nghiệm: Gieo các giống lúa trên khay, khi cây mạ được 2 lá (khoảng 7 ngày tuổi) nhổ mạ ra khỏi khay, dùng giấy thấm nước quấn dưới gốc. Sau đó đặt riêng lẻ cây mạ vào ống nghiệm (3cm x 20cm), để qua 1 đêm. Dùng ống hút thả 3 rầy non tuổi 2 vào một ống nghiệm. Đầu ống nghiệm được bọc bằng vải mỏng. Thí nghiệm tiến hành trên 61 giống lúa, nhắc lại 20 lần.
- Phương pháp trong hộp mạ: Gieo tất cả các giống lúa cần đánh giá vào chung một khay lớn (80cm x 15cm x 5cm). Một giống được gieo 10 cây thành một hàng theo chiều rộng của hộp. Đặt khay vào lồng nuôi rầy, giữ nước đủ ẩm cho cây lúa. Bảy ngày sau khi gieo, thả rầy nâu tuổi 2 (3 con/ cây lúa) vào trong khay bằng cách lấy những cây lúa bị hại nặng có mang rầy nâu từ lồng nuôi rầy nâu, vỗ nhẹ những cây này cho rầy rơi vào khay lúa. Thí nghiệm tiến hành trên 61 giống lúa, nhắc lại 5 lần.
Theo dõi chỉ tiêu cấp hại của cây mạ vào 5 và 7 ngày sau lây nhiễm (SLN). Kết quả đánh giá căn cứ vào bảng phân cấp hại theo triệu chứng của cây mạ và tỷ lệ rầy chết (đối với phương pháp trong ống nghiệm) và triệu chứng của cây mạ (đối với phương pháp trong khay mạ). Sau đó sử dụng bảng phân mức độ kháng của IRRI để xác định khả năng kháng rầy nâu của các giống lúa (Bảng
2.2; Bảng 2.3).
2.5.2.2. Phương pháp nhận diện sự có mặt của các gen kháng rầy nâu trong các giống lúa có biểu hiện kháng rầy nâu giống lúa có biểu hiện kháng rầy nâu
* Tách chiết DNA tổng số: Tách chiết DNA tổng số được thực hiện theo
phương pháp Kang và cs (2003) [58].
Lá mạ non (0,5-1 g) của cây lúa sau khi gieo 20 ngày, được nghiền thành bột mịn trong dung dịch nitơ lỏng, sau đó cho vào ống eppendorf (khoảng 2/3
43
thể tích ống). Bổ sung 500 µl đệm chiết DNA pH 7,5 (100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA) và 20% SDS vào mỗi ống eppendorf ở trên và ủ ở 650C trong 30 phút. Trong thời gian ủ, cứ 10 đến 15 phút lại lắc nhẹ một lần. Hết thời gian ủ ở 60°C, các ống chứa mẫu được lấy ra và thêm 500 µl dung dịch clorofoml:isoamyl (24:1). Lắc nhe trong 10 phút. Ly tâm 3000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau ly tâm, dùng pipethút lấy dịch trên cho sang ống eppendorf 1,5 ml mới rồi cho thêm thể tích isopropanol tương đương và lắc nhẹ. Sau khi ADN kết lại và nổi trong dung dịch, tiếp tục ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút để thu ADN và loại bỏ hết dịch trên. Rửa ADN bằng côn 75%. ADN được làm khô mẫu bằng máy cô chân không (Modul 3180C, BioTron). ADN được hòa tan với 20 µl nước cất vô trùng. Sau khi ADN được hòa tan, cho thêm 5 µl dung dịch Ribonuclease A để loại bỏ RNA, lắc nhẹ rồi ủ 30 phút ở 37°C. Dung dịch DNA tổng số được kiểm tra nồng độ trên máy quang phổ (SmartSpecTM3000, BioRad) ở bước sóng λ260/280 nm. Chất lượng DNA được kiểm tra bằng điện di trên agarose gel 0,8% ở 100V. Đệm điện di được sử dụng là 1x TAE (0,04 M Tris-acetate và 0,001 M EDTA). Nhuộm agarose gel 15 phút trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) (0,5 µg/L) và phân tích hình ảnh điện