Như các tài liệu đã công bố và khẳng định, nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men lactic và chất lượng sản phẩm mắm tôm chua. Thông thường, trong dân gian, người ta thấy rằng mùa nắng, mùa hè, mùa có nhiệt độ cao, lên men mắm tôm chua nhanh chín; mùa mưa, mưa đông, mùa có nhiệt độ thấp, lên men mắm tôm chua lâu chín hơn. Nhiệt độ càng cao (trong mức giới hạn về nhiệt độ) thì quá trình lên men mắm tôm chua càng nhau, lượng axit chung tích lũy trong môi trường (bao gồm cả axit lactic) càng nhiều.
Thí nghiệm 3.4: Tìm hiểu ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến sự sinh trưởng của VK lactic được phân lập.
Căn cứ vào luận điểm trên, chúng tôi tiến hành thử khả năng sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 phân lập từ mắm tôm chua trên môi trường MRS lỏng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Để xác định được giới hạn sinh thái về yếu tố nhiệt độ của 2 chủng NB1 và NB5, chúng tôi nuôi cấy chúng ở các điều kiện nhiệt độ như sau: 15 oC; 20oC; 25oC, 30oC; 35oC, 40oC; 45oC trong 72 giờ, đo OD620 nm ở các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. Kết quả đo OD620 nm được tổng hợp như bảng sau:
Bảng 4.10: Kết quả đo OD620 nm khi nuôi cấy NB1 và NB5 ở các nhiệt độ khác nhau. OD620 nm TRUNG BÌNH
Chủng NB1 NB5
24 giờ 36 giờ 48 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ
15 oC 0.093 0.109 0.113 0.009 0.112 0.105 20 oC 0.975 1.514 1.755 0.890 1.325 1.569 25 oC 1.348 1.896 1.904 1.297 1.960 2.001 30 oC 1.820 1.995 2.120 2.010 2.359 2.503 35 oC 1.569 2.006 2.019 1.342 1.791 1.943 40 oC 1.011 1.382 1.720 0.939 1.221 1.450 45 oC 0.232 0.312 0.429 0.056 0.039 0.044
Ta nhận thấy, chủng NB1 sinh trưởng cực thuận ở điều kiện nhiệt độ ngưỡng 30oC. Tuy nhiên, chúng cũng sinh trưởng rất tốt ở ngưỡng nhiệt 25oC và 35oC. Có thể nói rằng, chủng NB1 và NB5 sinh trưởng tốt trong khoảng 30oC ± 5 oC. Ở ngưỡng 20oC và 40 oC, chúng sinh trưởng chậm. Ở ngưỡng 15 oC, chúng hầu như không sinh trưởng, chứng tỏ khả năng chịu nhiệt độ thấp của 2 chủng NB1 và NB5 kém. Ở ngưỡng 45 oC, chúngcũng sinh trưởng kém, rất chậm, chứng tỏ khả năng chịu nhiệt độ cao cũng chỉ ở mức trung bình. Như vậy, 2 chủng NB1 và NB5 là các chủng VK ưa ấm.
Như các tài liệu đã nghiên cứu, người ta thấy rằng muối ăn (NaCl) có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của VK lactic và sự tích lũy acid lactic trong dịch lên men. Hàm lượng muối ăn khoảng 6 % sẽ làm giảm đi đến 30 % sự hoạt động của VK lactic nói chung. Như vậy, với hàm lượng muối NaCl sử dụng khác nhau thì lượng acid lactic tạo ra trong quá trình sản xuất mắm tôm chua cũng khác nhau.
Để tìm hiểu ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của 2 chủng NB1
và NB5, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên môi trường MRS lỏng có bổ sung các nồng độ muối NaCl khác nhau, nuôi tĩnh ở 30 oC. Khả năng chịu mặn của chúng được đánh giá qua việc xác /định mật độ tế bào theo thời gian. Mật độ tế bào được xác định bằng mật độ quang OD 620 nm. Kết quả được trình bày ở bảng sau:
Bảng 4.11: Kết quả đo OD620 nm khi nuôi cấy NB1 và NB5 ở các nồng độ muối khác nhau.
OD620 nm TRUNG BÌNH
Chủng NB1 NB5
24 giờ 36 giờ 48 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ
0 % 1.790 1.919 1.994 1.934 2.202 2.404
2 % 1.632 1.710 1.844 1.767 1.923 2.023
4 % 1.445 1.541 1.692 1.507 1.676 1.890
6 % 0.962 1.167 1.221 1.061 1.134 1.278
8 % 0.344 0.528 0.495 0.201 0.199 0.233
Ta thấy, chủng NB1 là chủng chịu mặn khá tốt. Ở nồng độ muối từ 2 – 4 %, chúng vẫn sinh trưởng bình thường. Ở nồng độ muối 6 %, chúng sinh trưởng chậm, ở nồng độ muối 8 %, chúng gần như không sinh trưởng, bị ức chế hoạt động.
Ta thấy, khả năng chịu mặn của chủng NB1 khá giống với chủng NB1, chúng có thể sinh trưởng tốt ở điều kiện nồng độ NaCl đạt 2 – 4 %. Ở nồng độ 6 %, chúng bắt đầu sinh trưởng chậm lại, đến khi nồng độ muối 8%, chúng gần như không sinh trưởng.
Như vậy, ta có thể kết luận rằng, 2 chủng NB1 và NB5 có khả năng chịu mặn tốt ở nồng độ 2 – 4 %. Nếu muối ở nồng độ 6 – 8 %, chúng sinh trưởng chậm và gần như không sinh trưởng.
4.4. Kết quả tìm hiểu tác dụng kháng khuẩn của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
Bên cạnh đặc tính sinh acid lactic của VK lactic, chúng còn được người ta biết đến với khả năng ức chế các VSV khác. Chúng tôi đã sử dụng phương pháp đục lỗ thạch với dịch nuôi cấy ở 72h.
4.4.1. Thí nghiệm 4.1. Tìm hiểu tác dụng kháng khuẩn đơn loài của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua lập từ mắm tôm chua
Chúng tôi đã sử dụng 6 chủng VSV chỉ thị đã nêu trên: Chủng Bacillus sp.
Chủng E. Coli
Chủng Salmonella sp. Chủng Pseudomonas sp. Chủng Staphylococcus “trắng” Chủng Staphylococcus “vàng”
Với 2 chủng Bacillus sp. và Pseudomonas sp., chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy LB, còn với 4 chủng còn lại, chúng tôi sử dụng môi trường thạch dinh dưỡng – Nutrient Agar. Đây đều là những môi trường ưa thích để các VSV chỉ thị sinh trưởng và phát triển. Kết quả thu được như sau:
2 chủng NB1 và NB5 đều có khả năng kháng khuẩn với cả 6 chủng VSV chỉ trị trên, chúng đều tạo ra các vòng tròn vô khuẩn xung quanh các lỗ thạch.
Đối với từng chủng VSV chỉ thị, 2 chủng NB1 và NB5 có khả năng kháng khuẩn, thể hiện bằng các vòng tròn vô khuẩn với bán kính (D – d, mm) khác nhau. Kích thước bán kính vòng tròn vô khuẩn được trình bày ở bảng sau:
Bảng 4.13: Hoạt tính ức chế khuẩn của 2 chủng NB1 và NB5.
Hoạt tính ức chế khuẩn (D – d, mm) TRUNG BÌNH
Chủng VSV chỉ thị NB1 NB5 Bacillus sp. 8.2 7.5 Pseudomonas sp. 6.2 6.7 E. Coli 3.5 3.9 Salmonella sp. 3.0 2.4 Staphylococcus “trắng” 4.5 4.2 Staphylococcus “vàng” 4.1 4.5
Hình 4.11: Vòng tròn kháng khuẩn của chủng NB1 với Bacillus sp.
Hình 4.12: Vòng tròn kháng khuẩn của chủng NB1 với Staphylococcus “vàng”
Với những kết quả kháng khuẩn như trên, ta có thể thấy rằng, 2 chủng NB1 và NB5 có khả năng ức chế tất cả các VSV chỉ thị trên. Ta nhận thấy, 2 chủng NB1 và NB5
kháng 2 chủng VK chỉ thị là Bacillus sp. và Pseudomonas sp. khá mạnh, trong khi khả năng kháng 4 chủng VK chỉ thị còn lại là tương đối yếu.
Khả năng kháng khuấn với phổ kháng khuẩn rộng và khá mạnh của chủng NB1
dựa trên 2 yếu tố cơ bản: Khả năng sinh acid lactic làm acid hoá môi trường – gây bất lợi cho sự sinh trưởng của các VSV đối kháng, có thể có khả năng sinh bacterioxin – chất có khả năng ức chế VSV khác. Phạm vi của thí nghiệm này chỉ dừng ở mức đánh giá tổng quan khả năng kháng khuẩn của 2 chủng phân lập, chưa xác định được khả năng kháng khuẩn của chúng trong trường hợp trung hoà hoặc không trung hoà acid lactic trong dịch lên men.
Nói tóm lại, 2 chủng NB1 và NB5 có phố kháng khuẩn rộng, tuy khả năng kháng khuẩn chưa cao. Kết hợp với công thức phối trộn muối hợp lý – khoảng 2 – 4 % NaCl, ta có thể thu được hiệu quả ức chế khuẩn cao hơn. Đây sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới, nhằm kết hợp các yếu tố trong quá trình làm mắm tôm chua để tăng tối đa khả năng kháng khuẩn của các chủng VK lactic. Qua đây, ta cũng thấy được rằng, mắm tôm chua chứa các VSV (ở đây là VK lactic) có khả năng kháng lại các VSV gây thối, gây bệnh khác, nó có thể coi là một thực phẩm “sạch” – an toàn và có lợi.
4.5. Kết quả tìm hiểu quá trình lên men trong quy trình sản xuất mắm tôm chua ở quy mô phòng thí nghiệm ở quy mô phòng thí nghiệm
Sau khi đã phân lập và tìm hiểu được các đặc điểm sinh học của 2 chủng NB1
và NB5, chúng tôi tiếp tục ứng dụng chúng vào quá trình sản xuất mắm tôm chua thực tế ở quy mô phòng thí nghiệm.
Để tìm hiểu về quá trình lên men, chúng tôi kiểm tra chất lượng của sản phẩm mắm tôm chua qua từng giai đoạn, thông qua các chỉ tiêu như sau:
Sự thay đổi màu sắc của tôm. Sự thay đổi độ dai của tôm.
Sự thay đổi màu sắc của mắm tôm chua. Sự thay đổi mùi của mắm tôm chua.
Sự thay đổi vị của mắm tôm chua. Sự thay đổi pH của mắm tôm chua.
Như vậy, chúng tôi sẽ tìm hiểu và xác định sự khác biệt giữa lên men mắm tôm chua truyền thống và lên men mắm tôm chua với sự bổ sung của 2 chủng NB1 và NB5, từ đó có thể rút ra được phương pháp lên men cải tiến mới do chúng tôi đề xuất.
4.5.1. Thí nghiệm 5.1. Tìm hiểu sự thay đổi các giá trị cảm quan của mắm tôm chua trong quá trình sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm trong quá trình sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm
Mục đích tiến hành thí nghiệm này nhằm tìm hiểu sự thay đổi các giá trị cảm quan của mắm tôm chua giữa sản xuất mắm tôm chua bằng phương pháp truyền thống và sản xuất mắm tôm chua bằng cách c từ đó có thể sơ bộ xác định các đặc điểm để nhận biết sự “chín” của sản phẩm.
Thí nghiệm được tiến hành theo 3 quy trình như sau:
Lên men tự nhiên theo phương pháp truyền thống (ký hiệu là CT511).
Lên men với sự tham gia của dịch nuôi cấy 2 chủng NB1 và NB5 (với tỷ lệ 1 – 1) ở 2 mức:
o Dịch nuôi cấy 10 % (ký hiệu là CT512).
o Dịch nuôi cấy 100 % (ký hiệu là CT513).
Bên cạnh sự thay đổi pH của mắm tôm chua, các giá trị cảm quan được chúng tôi quan tâm bao gồm:
Màu sắc của tôm (ký hiệu là MST). Độ dai của tôm (ký hiệu là ĐDT).
Màu sắc của dịch mắm tôm chua (ký hiệu là MSMTC). Mùi của dịch mắm tôm chua (ký hiệu là MMTC). Vị của dịch mắm tôm chua (ký hiệu là VMTC).
Như vậy, áp dụng phương pháp làm mắm tôm chua chung, chúng tôi tiến hành sản xuất mắm tôm chua ở quy mô phòng thí nghiệm theo 3 hướng trên, đánh giá các chỉ tiêu định kỳ 5 ngày / 1 lần kiểm tra. Kết quả được xác định bằng bảng sau:
Bảng 4.14: Kết quả đo các giá trị cảm quan trong quá trình lên men mắm tôm chua. Chỉ tiêu CT pHMTC TRUNG BÌNH MST TRUNG BÌNH ĐDT TRUNG BÌNH MSMTC TRUNG BÌNH MMTC TRUNG BÌNH VMTC TRUNG BÌNH CT511 0 ngày 6.7 2 79.0 1 1 1 5 ngày 6.0 2 63.7 2 2 2 10 ngày 5.2 3 60.4 3 3 3 15 ngày 4.2 5 58.9 5 5 5 20 ngày 4.4 5 57.5 5 5 5 25 ngày 4.6 5 57.0 5 5 5 CT512 0 ngày 6.2 2 79.0 1 1 1 5 ngày 4.6 3 53.2 3 3 2 10 ngày 4.0 5 55.9 5 5 5 15 ngày 4.6 5 52.6 5 5 5 20 ngày 5.1 5 52.0 5 5 5 25 ngày 5.5 4 51.6 5 4 5 CT513 0 ngày 5.0 2 79.0 1 1 1 5 ngày 3.8 5 70.5 5 5 5 10 ngày 4.6 5 67.2 5 5 5 15 ngày 4.9 5 66.1 5 5 5 20 ngày 5.1 4 65.7 5 5 5 25 ngày 5.5 4 56.6 5 4 4
Chú thích: Giá trị pH đo bằng máy đo pH cầm tay.
Giá trị càm quan MST, MSMTC, MMTC, VMTC tính trên thang điểm 5. Giá trị ĐDT đo bằng máy đo độ dai của thịt, đơn vị Newton.
Hình 4.15: Sự khác nhau giữa màu sắc dịch mắm của 3 công thức lên men sau 10 ngày
Với các kết quả thu được và những hiện tượng quan sát được, chúng tôi sơ bộ đưa ra những luận điểm sau:
Trong quá trình lên men mắm tôm chua nói chung, 2 quá trình sinh hóa đã xảy ra là quá trình lên men lactic (bao gồm quá trình sinh trưởng và phát triển của VK lactic và quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic) và quá trình thủy phân protein. 2 quá trình này được chúng tôi nhận biết bằng sự thay đổi đổi pH của dịch lên men theo chiều hướng acid hóa, sự chuyển hóa đường thành acid lactic làm lượng đường giảm dần theo thời gian, thay đổi của độ dai của tôm nguyên liệu theo chiều hướng giảm dần. Ngoài ra, do quá trình lên men lactic xảy ra nhiều giai đoạn, tạo ra nhiều sản phẩm trung gian; theo thời gian, hương vị đặc trưng của mắm tôm chua là sự phối hợp giữa các hợp chất trên tạo ra. Mặt khác, trong môi trường acid, protein của tôm bị biến tính tạo cho tôm có màu đỏ đẹp và quan trọng hơn tạo cho tôm rắn chắc. Lý do làm cho tôm có màu đỏ đẹp là do sự biến tính của protein làm astaxanthin (vốn là hợp chất kết hợp với protein tạo phức bền vừng) bị oxy hóa thành astaxin tự do có màu gạch đỏ.
Đối với CT511, quá trình lên men mắm tôm chua đạt yêu cầu về các giá trị cảm quan sau 15 ngày. Đối với CT512, quá trình này đạt yêu cầu sau 10 ngày trong khi quá trình lên men này đạt yêu cầu chỉ sau 5 ngày với CT513. Như vậy, ta có thể thấy rằng, việc bổ sung dịch nuôi cấy VK lactic vào mẻ lên men giúp rút ngắn thời gian lên men, mắm tôm chua nhanh đạt “chín”.
Mặt khác, đối với các công thức bổ sung dịch nuôi VK lactic, sau khi các mắm tôm chua đã lên men “chín”, chúng bắt đầu có hiện tượng tăng nhẹ pH trong dịch lên men. Độ dai của tôm giảm dần, các giá trị cảm quan khác của sản phẩm bắt đầu giảm dần. Quá trình giảm chất lượng các giá trị cảm quan bắt đầu xảy ra khoảng thời điểm 25 ngày lên men (tức là 15 ngày kể từ thời điểm chín) đối với CT512; khoảng thời điểm 20 ngày lên men (tức là 15 ngày kể từ thời điểm chín) đối với CT513. Thực chất là quá trình phân hủy Protein. Nó được thực hiện bởi sự phát triển từ các VSV xâm nhiễm vào sản phẩm, ví dụ như nấm mốc chủng Mucor, Aspergillus, Penicilium bên cạnh những VSV gây thối khác. Sở dĩ chúng tồn tại, sinh trưởng và phát triển được ở giai đoạn này do pH của dịch nuôi cấy đã tăng (acid lactic bị chính VK lactic sử dụng làm cơ chất). Đây là một quá trình có hại, làm giảm chất lượng của sản phẩm, cần xem xét kỹ để có thể đưa ra những biện pháp khắc phục hiệu quả.
Đặc điểm để xác định mắm tôm chua đã đạt độ chín: sau một thời gian (2 – 3 ngày) khi pH của môi trường đạt mức acid cao nhất (trung bình khoảng 3.8 – 4.1); độ dai của tôm đạt trung bình khoảng 55.0 – 66.0 (N); các giá trị cảm quan (bao gồm VMTC, MMTC, MSMTC, MST, ĐDT) đạt thang điểm 5.
4.5.2. Thí nghiệm 5.2. Tìm hiểu phương pháp làm mắm tôm chua cải tiến trên quy mô phòng thí nghiệm mô phòng thí nghiệm
Với các kết quả thu được từ các thí nghiệm trên, trước khi tiến hành thử nghiệm phương pháp làm mắm tôm chua cải tiến bổ sung thêm dịch nuôi cấy VK lactic, chúng tôi chú ý như sau:
Tôm nguyên liệu được cắt lớp vỏ bao đầu tôm. Bổ sung muối ăn với hàm lượng 4 %.
Bổ sung thêm một lượng rượu nhất định.
Sau khí đạt độ “chín”, sau 2 – 3 ngày cần sử dụng ngay hoặc phải sử dụng chất bảo quản (axit benzoic và sonbic cùng các muối của chúng …) để ức chế nấm mốc.
Mặt khác, sau quá trình tìm hiểu sự thay đổi các giá trị cảm quan của mắm tôm chua trong quá trình sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng, CT513 (dịch nuôi cấy ngập 100 % nguyên liệu) làm mắm tôm chua đạt độ chín nhanh
nhất. Tuy nhiên, để áp dụng quy mô sản xuất lớn hơn thì việc dịch nuôi cấy ngập 100% nguyên liệu là không hợp lý về vấn đề giá thành (môi trường MRS rất tốn kém). Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn và áp dụng công thức bổ sung 10 % dịch nuôi cấy.
Để thực hiện với quy mô phòng thí nghiệm, chúng tôi đã chuẩn bị nguyên liệu