Để thực hiện được nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic từ 3 mẫu mắm tôm chua, bao gồm mẫu mắm tôm chua Thái Bình, mẫu mắm tôm chua Huế và mẫu cà dầm tôm (một dạng sản phẩm khác của mắm tôm chua).
Quá trình phân lập VK lactic từ mẫu được tiến hành trên môi trường MRS. Đây là một môi trường ưa thích và gần như đặc hiệu đối với VK lactic, các VK khác hầu như rất khó phát triển.
Sử dụng phương pháp phân lập VSV cơ bản, chúng tôi đã phân lập được 6 dạng hình thái khuẩn lạc khác nhau, được đặt tên lần lượt là NB1 ÷ NB6. 6 chủng VK này được chúng tôi nuôi cấy tách riêng nhau để tạo độ thuần nhất định trên môi trường thạch MRS. Sau đó chúng lần lượt được nuôi trong môi trường MRS lỏng, ở 30 oC trong 24 giờ để kiểm tra sự có mặt của acid lactic trong dịch nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm được phân tích ở bảng như sau:
Bảng 4.1: Kết quả phân lập 6 chủng VK từ mắm tôm chua Chủng
Chỉ tiêu NB
1 NB2 NB3 NB4 NB5 NB6
Sinh trưởng trên môi
trường thạch MRS (+) (+) (+) (+) (+) (+) pH môi trường Giấy quỳ tím hóa hồng đỏ Giấy quỳ tím hóa xanh Giấy quỳ tím hóa xanh Giấy quỳ tím hóa xanh Giấy quỳ tím hóa hồng đỏ Giấy quỳ tím hóa xanh Acid Acid
Nhận biết acid lactic
trong dịch (+) Ø Ø Ø (+) Ø
Chú thích: (+) Cho kết quả dương tính. Ø Không tiến hành thí nghiệm
Như vậy, từ 3 mẫu thu thập, chúng tôi bước đầu đã phân lập được 2 chủng VK, đặt trên là NB1 và NB5. 2 chủng VK này có 2 đặc điểm quan trọng:
Sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường thạch MRS. Có khả năng sinh acid lactic.
Hai chủng NB1 và NB5 được tiến hành tinh sạch và giữ giống trên môi trường thạch MRS và môi trường MRS lỏng ở điều kiện lạnh thường để tiếp tục tiến hành các thí nghiệm sau.
4.2. Kết quả tìm hiểu đặc tính sinh học của các chủng VK sinh acid lactic
Tìm hiểu đặc tính sinh học của 2 chủng NB1 và NB5 nhằm bước đầu xác định đơn vị phân loại của chủng VK. Để có thể sơ bộ đánh giá, chúng tôi thực hiện các thí nghiệm sau đây:
Gram của VK.
Hoạt tính catalase. Kiểu lên men của VK. Hoạt tính protease.
Khả năng sinh acid lactic.
Khả năng đồng hóa các loại đường.
4.2.1. Thí nghiệm 2.1. Tìm hiểu đặc điểm hình thái học khuẩn lạc của các chủng lựa chọn. lựa chọn.
Sau khi phân lập được 2 chủng NB1 và NB5 có khả năng sinh acid lactic, chúng tôi tiếp tục tiến hành thí nghiệm xác định đặc điểm hình thái học khuẩn lạc của chúng. Bằng phương pháp cấy trang dịch pha loãng ở nồng độ 10 -6 trên môi trường thạch MRS, nuôi cấy ở 30oC và theo dõi ở các thời điểm: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, sau 72 giờ, chúng tôi thu được kết quả được phân tích ở bảng như sau:
Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 2 chủng NB1 và NB5
Chủng Giờ theo dõi
Hình thái khuẩn lạc Chủng NB1
Hình thái khuẩn lạc Chủng NB5
24 giờ nuôi cấy
- Kích thước đường kính trung bình: 0.8 – 0.9 (mm).
- Hình dáng: Hình tròn. - Màu sắc: Màu trong.
- Kích thước đường kính trung bình: 1.1 – 1.3 (mm).
- Hình dáng: Hình tròn. - Màu sắc: Màu trắng đục
48 giờ nuôi cấy
- Kích thước đường kính trung bình: 1.5 – 2.5 (mm).
- Hình thái: Hình tròn.
- Đặc điểm: Bóng, trơn, nhẵn. Không có ria xung quanh khuẩn lạc. Bề mặt trên lồi nhiều.
- Màu sắc: Trắng sữa pha vàng.
- Kích thước đường kính trung bình: 1.7 – 2.5 (mm). - Hình thái: Hình tròn.
- Đặc điểm: Bóng, trơn, nhẵn. Không có ria xung quanh khuẩn lạc. Bề mặt trên hơi lồi.
- Màu sắc: Trắng đục.
Sau 72 giờ nuôi cấy
- Kích thước đường kính trung bình đạt mức ổn định ở 2.0 – 3.5 (mm).
- Hình thái: Hình tròn.
- Đặc điểm: Bóng, trơn, nhẵn. Không có ria xung quanh khuẩn lạc. Bề mặt trên lồi nhiều. Bề mặt dưới hoàn toàn không ăn sâu vào môi trường. - Màu sắc: Màu trắng sữa pha
vàng
- Kích thước đường kính trung bình đạt mức ổn định ở 2.3 – 3.3 (mm).
- Hình thái: Hình tròn.
- Đặc điểm: Bóng, trơn, nhẵn. Không có ria xung quanh khuẩn lạc. Bề mặt trên hơi lồi. Bề mặt dưới hoàn toàn không ăn sâu vào môi trường.
Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc của chủng NB1
Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc của chủng NB5
Sơ bộ xác định được đặc điểm hình thái học khuẩn lạc của 2 chủng NB1 và NB5
như sau:
Đặc điểm hình thái học khuẩn lạc của chủng NB1:
o Khuẩn lạc hình tròn, trơn, bóng, nhẵn, lồi.
o Khuẩn lạc màu trắng sữa pha vàng.
o Khi ổn định về kích thước, đường kính khuẩn lạc đạt khoảng 2.0 – 3.5 (mm). Đặc điểm hình thái học khuẩn lạc của chủng NB5:
o Khuẩn lạc hình tròn, trơn, bóng, nhẵn, lồi.
o Khi ổn định về kích thước, đường kính khuẩn lạc đạt khoảng 2.3 – 3.3 (mm).
4.2.2. Thí nghiệm 2.2. Đặc điểm hình thái học tế bào của 2 chủng đã phân lập.
Sau khi xác định hình thái, kích thước, đặc điểm khuẩn lạc của 2 chủng NB1 và NB5, chúng tôi tiếp tục chuyển sang phần thứ hai của thí nghiệm đánh giá hình thái, đó là quan sát và nhận biết hình thái, đặc điểm tế bào học của 2 chủng NB1 và NB5.
Như đã trình bày ở trên, bằng phương pháp nhuộm Gram và tiến hành soi mẫu trên kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy tế bào của cả 2 chủng NB1 và NB5 đều bắt màu tím của thuốc nhuộm (Tím gentian). Điều đó chứng tỏ 2 chủng NB1 và NB5 thuộc VK Gram dương (+). Kết quả của thí nghiệm được minh họa bằng hình ảnh sau:
Hình 4.3: Ảnh chụp tiêu bản nhuộm tế bào của chủng NB1
4.2.3. Thí nghiệm 2.3. Hoạt tính catalase của 2 chủng NB1 và NB5.
Trong quá trình quan sát và theo dõi hình thái học khuẩn lạc của 2 chủng NB1
và NB5, đồng thời tiến hành thử hoạt tính catalase của chúng. Kết quả được phân tích như sau:
Khi nhỏ 1 giọt nước oxy già (H2O2) lên bề mặt khuẩn lạc VK, chúng tôi quan sát thấy không có hiện tượng gì xảy ra (không sủi bọt trên bề mặt khuẩn lạc) đối với cả 2 chủng NB1 và NB5. Như vậy:
→ 2 chủng NB1 và NB5 không có khả năng phân giải H2O2 (để giải phóng O2), nghĩa là chúng không có hoạt tính catalase (-).
→ Điều đó chứng tỏ, 2 chủng NB1 và NB5 là VK kỵ khí.
4.2.4. Thí nghiệm 2.4. Xác định kiểu lên men của 2 chủng nghiên cứu.
Theo kiến thức về 2 kiểu lên men đồng hình và dị hình, ta biết rằng trong quá trình sinh trưởng của VK lên men dị hình có sinh khí CO2 … Điều này là cơ sở tiến hành xác định kiểu lên men của 2 chủng đã phân lập.
Bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh trong môi trường MRS (pH 6.5 ± 0.2, to = 30 oC), đặt thêm các ống Dunham vào ống nghiệm và theo dõi quá trình lên men. Quan sát quá trình nuôi cấy thấy:
Sau 24 giờ nuôi cấy, kiểm tra pH của dịch lên men thấy quỳ tím hóa hồng – đỏ, nghĩa là pH của dịch đạt acid, chứng tỏ đã có sự sinh trưởng của VK và tạo thành acid lactic, làm acid hóa môi trường.
Mặt khác, quan sát thấy ống Dunham trong ống nghiệm không nổi lên, không có bọt khí trong ống Dunham cũng như ở dịch nuôi cấy, không thấy sủi bọt.
Như vậy, 2 chủng NB1 và NB5 đều sinh trưởng, sinh ra acid làm acid hóa dịch nuôi cấy, nhưng quá trình lên men không sinh ra khí (CO2 …). Điều đó giúp chúng tôi sơ bộ kết luận rằng, quá trình lên men của 2 chủng NB1 và NB5 là lên men đồng hình. Chúng thực hiện lên men đồng hình theo phản ứng sau:
C6H12O6 2 CH3-CHOH-COOH + 94 kcal. (glucose) (acid lactic)
4.2.5. Thí nghiệm 2.5. Hoạt tính protease của các chủng nghiên cứu.
Theo phương pháp thử hoạt tính protease, chúng tôi sử dụng môi trường có bổ sung cơ chất casein. Kết quả cho thấy 2 chủng NB1 và NB5 có hoạt tính protease, nhưng vòng tròn hoạt tính protease (D – d, mm) rất bé, chứng tỏ hoạt tính không mạnh.
4.2.6. Thí nghiệm 2.6. Khả năng đồng hóa các loại đường của 2 chủng NB1 và NB5.
Để tìm hiểu khả năng đồng hóa các loại đường, chúng tôi sử dụng 3 loại đường phục vụ thí nghiệm này là: saccharose, maltose, galactose (bên cạnh glucose đã là thành phần tiêu chuẩn cho môi trường MRS).
Bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh trong môi trường MRS lỏng (pH 6.5 ± 0.2, to = 30 oC), thay thế lần lượt đường vào thành phần môi trường MRS với tỷ lệ tương đương, chúng tôi theo dõi và đánh giá các chỉ tiêu cơ bản (pH dịch lên men, sự có mặt của acid lactic) sau 24 giờ nuôi cấy. Kết quả được phân tích ở bảng như sau:
Bảng 4.3: Khả năng đồng hóa các loại đường của 2 chủng NB1 và NB5
Chủng NB1 NB5
pH Acid lactic pH Acid lactic Glucose Giấy quỳ tím hóa đỏ (+) Giấy quỳ tím hóa đỏ (+)
Saccharose Giấy quỳ tím hóa đỏ (+) Giấy quỳ tím hóa đỏ (+)
Maltose Giấy quỳ tím hóa đỏ (+) Giấy quỳ tím hóa đỏ (+)
Galactose Giấy quỳ tím hóa đỏ (+) Giấy quỳ tím hóa đỏ (+)
Chú thích: (+) Tồn tại acid lactic trong dịch nuôi cấy
Có thể thấy rằng, 2 chủng NB1 và NB5 có khả năng đồng hóa 4 loại đường cơ bản trên, chúng sinh trưởng và sinh ra acid lactic, làm acid hóa môi trường. Điều này sẽ làm cơ sở khi sản xuất bởi có thể thay đường mía cho glucose.
4.2.7. Sơ bộ định danh cho các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn
Tổng hợp các kết quả của các thí nghiệm trên, chúng tôi rút ra các đặc điểm sinh học của 2 chủng NB1 và NB5 được phân lập từ mắm tôm chua như sau:
Bảng 4.4: Đặc điểm phân loại học 2 chủng NB1 và NB5
Chủng
Đặc điểm NB1 NB5
Gram (+) (+)
Hoạt tính catalase (-) (-)
Mẫn cảm với O2 Kỵ khí Kỵ khí
Khả năng sinh acid lactic (+), không sinh khí (+), không sinh khí
Kiểu lên men Lên men đồng hình Lên men đồng hình
Hình thái tế bào Cầu khuẩn, tạo chuỗi Trực khuẩn, đứng
đơn, xếp đôi
Hoạt tính protease (+), yếu (+), yếu
Khả năng đồng hóa các loại đường:
Glucose Saccharose Maltose Galactose (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
Chú thích: (+) Cho kết quả dương tính. (-) Cho kết quả âm tính.
Như vậy, theo khóa phân loại Bergey, chúng tôi sơ bộ xếp 2 chủng NB1 và NB5
là 2 chủng VK lactic, NB1 là loài Streptococcus, NB5 là loài Lactobacillus.
4.3. Kết quả tìm hiểu một số điều kiện nuôi cấy VK lactic đã tuyển chọn.
Sau khi tìm hiểu các đặc tính sinh học của 2 chủng VK lactic NB1 và NB5, chúng tôi tiếp tục tìm hiểu về ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng của VK lactic, từ đó tìm hiểu quá trình tạo thành acid lactic và bacterioxin của chúng.
Như vậy, khía cạnh này được chúng tôi đánh giá ở các nội dung sau:
Tìm hiểu đường cong sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 (được tiến hành ở thí nghiệm 3.1).
Tìm hiểu sự tạo thành acid lactic của 2 chủng NB1 và NB5 (được tiến hành ở thí nghiệm 3.2).
Tìm hiểu sự tạo thành bacterioxin của 2 chủng NB1 và NB5 (được tiến hành ở thí nghiệm 3.3).
Tìm hiểu sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt độ, độ mặn) đến sự sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 (được tiến hành ở thí nghiệm 3.4; 3.5).
4.3.1. Thí nghiệm 3.1. Xác định đường cong sinh trưởng của VK lactic phân lập từ nguồn mắm tôm chua. nguồn mắm tôm chua.
Xác định đường cong sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 giúp ta kiểm soát được quá trình nuôi cấy và xác định được thời gian thích hợp nhất cho quá trình thu sinh khối. Ngoài ra, ta có thể sơ bộ xác định mối quan hệ giữa quá trình sinh trưởng, phát triển của VK lactic với khả năng sinh acid lactic, khả năng ức chế khuẩn của chúng.
Chúng tôi tiến hành xác định đường cong sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5
trên môi trường lỏng MRS, pH 6.5 trong tủ nuôi ổn nhiệt ở nhiệt độ 30 oC. Mẫu được đo OD đến thời điểm 96 giờ sau khi nuôi cấy, cứ 4 giờ nuôi cấy lấy mẫu một lần đo OD, mỗi lần đo được nhắc lại 3 lần. Sau đó, sử dụng phương pháp thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel. Kết quả theo dõi trị số đo OD khi nuôi cấy chủng NB1 và NB5
được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 4.5: Khả năng sinh trưởng của 2 chủng VK lactic xác định qua trị số đo OD620 nm
OD620 TRUNG BÌNH
Chủng
Thời gian NB1 NB5
04 giờ nuôi cấy 0.244 0.301
08 giờ nuôi cấy 0.540 0.695
12 giờ nuôi cấy 0.920 1.013
16 giờ nuôi cấy 1.231 1.321
20 giờ nuôi cấy 1.588 1.643
24 giờ nuôi cấy 1.854 1.976
28 giờ nuôi cấy 2.019 2.249
32 giờ nuôi cấy 2.029 2.340
36 giờ nuôi cấy 2.043 2.407
40 giờ nuôi cấy 2.059 2.410
44 giờ nuôi cấy 2.078 2.413
48 giờ nuôi cấy 2.080 2.409
52 giờ nuôi cấy 2.043 2.389
56 giờ nuôi cấy 2.010 2.298
60 giờ nuôi cấy 1.980 2.289
64 giờ nuôi cấy 1.979 2.256
68 giờ nuôi cấy 1.981 2.198
72 giờ nuôi cấy 1.982 2.190
Biểu đồ 4.1: Đường cong sinh trưởng của chủng NB1
Như vậy, dựa vào bảng số liệu và đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng NB1, chúng tôi sơ bộ đưa ra một số nhận xét sau:
Chủng NB1 phát triển mà bỏ qua giai đoạn thích ứng. Điều này được giải thích do môi trường hoạt hóa giống và môi trường lên men là giống nhau – Môi trường MRS dịch thể.
Giai đoạn phát triển của chủng NB1 khá dài, tính đến khoảng 24 – 28 giờ sau nuôi cấy.
Chủng NB1 đạt pha cân bằng ở khoảng 28 giờ sau nuôi cấy.
Giai đoạn cân bằng ở chủng NB1 diễn ra khá dài, từ khoảng 28 – 48 giờ sau nuôi cấy. Điều này chứng tỏ chủng NB1 có khả năng duy trì phát triển tốt.
Mật độ tế bào đạt giá trị cực đại khoảng 40 – 48 giờ sau nuôi cấy. Từ 48 giờ trở đi, tế bào chủng NB1 bắt đầu già hóa và chết dần.
Phương pháp nghiên cứu xác định đường cong sinh trưởng của chủng NB1 được chúng tôi tiếp tục áp dụng với chủng NB5, kết quả thu được được thể hiện bằng bảng số liệu và biểu đồ như sau:
Biểu đồ 4.2: Đường cong sinh trưởng của chủng NB5
Tương tự, dựa vào bảng số liệu và đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng NB5, chúng tôi đánh giá một vài nhận xét như sau:
Chủng NB5 phát triển mà bỏ qua giai đoạn thích ứng với môi trường lên men. Điều này cũng được giải thích giống như ở trường hợp nuôi cấy chủng NB1 do môi trường hoạt hóa giống và môi trường lên men là giống nhau – Môi trường MRS dịch thể.
Giai đoạn phát triển của chủng NB5 khá dài, tính đến khoảng 28 – 32 giờ sau nuôi cấy.
Chủng NB5 đạt pha cân bằng ở khoảng 36 giờ sau nuôi cấy.
Giai đoạn cân bằng ở chủng NB5 diễn ra khá dài, từ khoảng 36 – 52 giờ sau nuôi cấy. Điều này chứng tỏ chủng NB5 có khả năng duy trì phát triển tốt.
Mật độ tế bào đạt giá trị cực đại khoảng 40 – 48 giờ sau nuôi cấy. Từ 52 giờ trở đi, tế bào chủng NB1 bắt đầu già hóa và chết dần.
4.3.2. Khả năng sinh acid lactic của các chủng VK lactic phân lập từ mắm tôm chua. chua.
Khả năng sinh acid lactic làm acid hóa môi trường là một trong hai đặc tính quan trọng nhất của VK lactic được chúng tôi quan tâm và tìm hiểu ở mức định tính và định lượng như sau:
Tìm hiểu định tính khả năng sinh acid lactic của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua (được tiến hành ở thí nghiệm 3.2.1).
Tìm hiểu định lượng lượng acid lactic được sinh ra từ VK lactic phân lập từ