3.4.1.1. Thí nghiệm 1.1: Phân lập các chủng VK trên môi trường MRS dựa theo khả năng sinh acid lactic.
a. Mẫu thu thập
- Mắm tôm chua Thái Bình. - Mắm tôm chua Huế. - Mắm cà dầm tôm. b. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch MRS, môi trường MRS dịch thể. - Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri, ống nghiệm. c. Chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sinh trưởng trên môi trường MRS. - Sự biến thiên pH của dịch nuôi cấy VK.
- Nhận biết sự có mặt của acid lactic trong dịch nuôi cấy VK.
3.4.1.2. Thí nghiệm 2.1: Tìm hiểu đặc điểm hình thái học khuẩn lạc của VK có khả năng sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch MRS. - Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC. - Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đổi kích thước trung bình khuẩn lạc theo thời gian. - Sự thay đổi hình dạng khuẩn lạc theo thời gian..
- Sự thay đổi màu sắc khuẩn lạc theo thời gian.. - Đặc điểm khuẩn lạc theo thời gian.
3.4.1.3. Thí nghiệm 2.2: Tìm hiểu đặc điểm hình thái học tế bào của VK có khả năng sinh acid lactic được phân lập.
- Nhuộm Gram và tiến hành soi mẫu trên kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Xác định Gram của VK.
- Xác định hình dạng, kích thước của VK.
3.4.1.4. Thí nghiệm 2.3: Tìm hiểu hoạt tính catalase của VK có khả năng sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy khuẩn lạc: môi trường thạch MRS.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC, thời gian nuôi cấy t = 48 (h). - Hóa chất thử hoạt tính catalase: Nước oxy già (H2O2).
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bề mặt khuẩn lạc. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Quan sát hiện tượng trên bề mặt khuẩn lạc sau khi nhỏ hóa chất thử hoạt tính bằng mắt thường.
- Quan sát hiện tượng trên bề mặt khuẩn lạc sau khi nhỏ hóa chất thử hoạt tính bằng kính hiển vi.
3.4.1.5. Thí nghiệm 2.4: Tìm hiểu kiểu lên men của VK có khả năng sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC, thời gian nuôi cấy t = 24 (h). - Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự biến thiên pH của dịch lên men theo thời gian. - Sự thay đổi trong ống Dunham.
3.4.1.6. Thí nghiệm 2.5: Tìm hiểu hoạt tính protease của VK có khả năng sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường thử hoạt tính protease. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sinh protease của VK lactic.
3.4.1.7. Thí nghiệm 2.6: Tìm hiểu khả năng đồng hóa các loại đường của VK sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Đường phục vụ nghiên cứu: glucose, saccharose, maltose, galactose.
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể có bổ sung thành phần đường khác nhau.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC, thời gian nuôi cấy t = 24 (h).
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên ống nghiệm. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự biến thiên pH dịch lên men theo thời gian.
- Xác định sự tồn tại của acid lactic trong dịch lên men.
3.4.1.8. Thí nghiệm 3.1: Xác định đường cong sinh trưởng của VK lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể. - Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC. - Đo OD620 nm của dịch nuôi cấy theo thời gian. - Số lần nhắc lại: 3 lần trên bình nuôi cấy. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đổi giá trị OD620 nm theo thời gian.
3.4.1.9. Thí nghiệm 3.2.1: Xác định định tính khả năng sinh acid lactic của VK lactic được phân lập.
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch MRS có bổ sung CaCO3 0.05 %. - Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự sinh trưởng của khuẩn lạc của VK theo thời gian đo bằng độ đục OD ở bước sóng 620 nm.
- Sự thay đổi của vòng tròn hoạt tính xung quanh khuẩn lạc theo thời gian. - Sự biến thiên của bán kính vòng tròn hoạt tính (D – d, mm) theo thời gian.
3.4.1.10. Thí nghiệm 3.2.2: Xác định định lượng khả năng sinh acid lactic của VK lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS lỏng. - Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần theo phương pháp trung hòa NaOH. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Lượng (ml) NaOH 0.1 N trung bình đã sử dụng để trung hòa 100 (ml) dung dịch mẫu.
- Lượng acid lactic (g/100 ml mẫu) có trong mẫu.
3.4.1.11. Thí nghiệm 3.3: Xác định khả năng sinh bacterioxin của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch LB, môi trường thạch dinh dưỡng. - Điều kiện nuôi cấy: pH 7.0 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC (đối với môi trường LB), 37 ± 2.0oC (đối với môi trường thạch dinh dưỡng).
- VSV chỉ thị: Bacillus sp.; Pseudomonas sp.; E. Coli; Salmonella sp.; Staphylococcus “trắng”; Staphylococcus “vàng”.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri. b. Chỉ tiêu theo dõi
3.4.1.12. Thí nghiệm 3.4: Tìm hiểu ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến sự sinh trưởng của VK lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS lỏng.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.0 ± 0.2, các điều kiện nhiệt độ khác nhau. - Đo OD620 nm của dịch nuôi cấy theo thời gian.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bình nuôi cấy. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sinh trưởng bằng đo độ đục trên máy so màu OD620 (bước sóng 620 nm, kính lọc màu đỏ).
3.4.1.13. Thí nghiệm 3.5: Tìm hiểu ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể có bổ sung NaCl ở các nồng độ khác nhau.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.0 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC .
- Đo OD620 nm của dịch nuôi cấy theo thời gian để xác định khả năng sinh trưởng.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bình nuôi cấy. b. Chỉ tiêu theo dõi sinh trưởng
- Sự thay đổi giá trị OD620 nm theo thời gian.
3.4.1.14. Thí nghiệm 4.1: Tìm hiểu tác dụng kháng khuẩn đơn loài của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch LB, môi trường thạch dinh dưỡng. - Điều kiện nuôi cấy: pH 7.0 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC (đối với môi trường LB), 37 ± 2.0oC (đối với môi trường thạch dinh dưỡng).
- VSV chỉ thị: Bacillus sp.; Pseudomonas sp.; E. Coli; Salmonella sp.; Staphylococcus “trắng”; Staphylococcus “vàng”.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Kích thước bán kính vòng tròn kháng khuẩn (D – d, mm) đối với từng chủng.
3.4.1.15. Thí nghiệm 5.1: Tìm hiểu sự thay đổi các giá trị cảm quan của mắm tôm chua trong quá trình sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm
a. Bố trí thí nghiệm
- Lên men mắm tôm chua theo 2 phương pháp: truyền thống và bổ sung dịch nuôi cấy VK.
- Đánh giá các chỉ tiêu định kỳ 5 ngày / 1 lần kiểm tra. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đổi pH của mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiêu màu sắc tôm theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiêu độ dai tôm theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiêu màu sắc mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiêu màu mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiệu vị mắm tôm chua theo thời gian.
3.4.1.16. Thí nghiệm 5.2: Tìm hiểu phương pháp làm mắm tôm chua cải tiến trên quy mô phòng thí nghiệm
a. Bố trí thí nghiệm
- Lên men mắm tôm chua theo phương pháp cải tiến có bổ sung dịch nuôi cấy VK.
- Đánh giá các chỉ tiêu định kỳ 3 ngày / 1 lần kiểm tra. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đổi pH của mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiêu màu sắc tôm theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiêu độ dai tôm theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiêu màu sắc mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiêu màu mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiệu vị mắm tôm chua theo thời gian.
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu
lý và các bước tiến hành của các phương pháp nghiên cứu VSV nói chung [6], [7], [8]. Các phương pháp cơ bản đó bao gồm:
Phương pháp phân lập VSV.
Phương pháp nuôi cấy và bảo quản VSV.
Phương pháp nhuộm Gram và quan sát đặc điểm hình thái học tế bào VSV. Phương pháp xác định hoạt tính catalase của VSV.
Phương pháp xác định hoạt tính protease của VSV.
Phương pháp xác định khả năng đồng hóa các loại đường của VSV. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của VSV.
Phương pháp thống kê và xử lý số liệu.
Bên cạnh đó, chúng tôi cũng áp dụng những phương pháp nghiên cứu chỉ áp dụng cho VK lactic như sau.
3.4.2.1.Phương pháp nhận biết sự có mặt của acid lactic trong môi trường.
a. Phương pháp định tính
- Phương pháp sử dụng thuốc thử Uffelmann [6]:
o Điều chế thuốc thử Uffelmann: 20 (ml) H2O + 3 giọt FeCl3 + 3 giọt Phenol đậm đặc.
o Nhỏ dung dịch thuốc thử Uffelmann lên dịch nuôi cấy. Nếu có acid lactic, dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng.
- Phương pháp tạo kết tủa đen [7]:
o Acid lactic trong điều kiện có sự hiện diện của acid sunfuric và thuốc tím KMnO4 chuyển thành acetaldehyde. Acetaldehyde khi gặp hỗn hợp Ag/NH3 sẽ có màu đen. Dựa vào sự xuất hiện màu đen, người ta xác định có sự hiện diện của acid lactic trong dịch.
o Cách thực hiện: Lấy 1 ống nghiệm. Cho vào đó 5 – 7 ml dịch lên men. Sau đó cho vào 1 ml H2SO4 rồi đem đun sôi. Cho vào vài giọt KMnO4, đặt vào ống nghiệm 1 tờ giấy lọc (tẩm 10 – 20 ml AgNO3 + 2 ml dung dịch NH4OH). Quan sát hiện tượng.
- Phương pháp xác định khả năng sinh acid lactic trên môi trường MRS bổ sung CaCO3 0.05 %.
pH 6.5 ± 0.2, nhiệt độ 30 oC.
o Theo dõi sự hình thành vòng tròn hoạt tính sinh acid xung quanh khuẩn lạc. b. Phương pháp định lượng [6]:
- Lượng acid lactic có trong dịch mẫu có thể được biểu diễn bằng độ Therner (To). Độ Therner chính là số ml dung dịch NaOH dùng để trung hòa lượng acid lactic có trong 100 ml dung dịch mẫu. Dung dịch phenolphthalein 1 % trong môi trường acid không màu, khi lượng acid bị trung hòa bởi NaOH thì phenolphthalein chuyển sang màu hồng.
- Công thức tính độ Therner: To = n. 100/ V
A % = To x 0.009
Trong đó: n (ml): Lượng NaOH 0.1 N đã dùng để trung hòa 100 ml dung dịch mẫu. V (ml): thể tích dịch lên men.
To (ml): Lượng NaOH đã dùng để trung hòa 100 ml dung dịch mẫu. A % (g/100 ml mẫu): Lượng acid lactic trong 100 ml dung dịch mẫu - Cách thực hiện:
o Cho vào lọ 10 ml dịch lên men, bổ sung H2O cho đủ 100 ml.
o Cho vào mẫu một ít phenolphthalein.
o Dùng NaOH 0.1 N để chuẩn độ đến khí xuất hiện màu hồng bền thì ngừng lại.
3.4.2.2. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái học khuẩn lạc VK lactic
- Cấy trang dịch pha loãng VK lactic ở nồng độ pha loãng 10-6 trên môi trường thạch MRS, điều kiện nhiệt độ 30 ± 0.2 oC.
- Theo dõi các chỉ tiêu sau ở các thời điểm: 24 giờ, 48 giờ, sau 72 giờ:
oKhả năng phát triển của khuẩn lạc.
oMàu sắc khuẩn lạc.
oHình dáng khuẩn lạc.
oBề mặt khuẩn lạc.
oKích thước khuẩn lạc.
3.4.2.3. Phương pháp xác định kiểu lên men của VK lactic
Chủng được nuôi cấy trong ống nghiệm chứa môi trường MRS lỏng, trong ống nghiệm đặt úp ngược ống Durham chìm trong dịch môi trường. Sau 24h nuôi cấy, nếu có bong bóng khí xuất hiện trong ống Durham có nghĩa là chủng nghiên cứu có sinh khí. Ngược lại không có khả năng sinh khí [6].
Những chủng có sinh khí là những chủng lên men lactic dị hình. Những chủng không sinh khí có kiểu lên men lactic đồng hình.
3.4.2.4.Phương pháp xác định khả năng sinh bacterioxin của VK lactic
- Chủng cần xác định được nuôi trong môi trường MRS lỏng trong 24h ở 350C. Ly tâm dịch nuôi ở 10000v/ph loại bỏ sinh khối.
- Dịch ly tâm được chuẩn độ về pH trung tính 7.0 bằng dung dịch NaOH 0.1 N. - Lấy tăm vô khuẩn ngâm trong dịch đã xử lý.
- VSV chỉ thị được cấy trên môi trường thích hợp, đặt tăm thấm dịch vào đĩa, đem nuôi ở nhiệt độ thích hợp trong 48h.
- Quan sát sự thay đổi và sự hình thành các vùng vô khuẩn xung quanh tăm.
3.4.2.5. Phương pháp xác định ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến sự sinh trưởng của VK lactic
- Nuôi cấy các chủng VK lactic trong môi trường MRS dịch thể, pH 6.5 ± 0.2 ở các nhiệt độ khác nhau: 15oC, 20 oC, 25 oC, 30 oC, 35 oC, 40 oC, 45 oC.
- Đo mật độ quang học ở bước sóng 620 nm của dịch lên men ở các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ.
3.4.2.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của VK lactic
- Nuôi cấy các chủng VK lactic trong môi trường MRS dịch thể, pH 6.5 ± 0.2 ở nhiệt độ 30 oC. Bổ sung muối ăn NaCl ở các nồng độ khác nhau 0 %, 2 %, 4 %, 6 %, 8 %.
- Đo mật độ quang học ở bước sóng 620 nm của dịch lên men ở các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ.
3.4.2.7. Phương pháp xác định khả năng kháng khuấn của VK lactic
- Sử dụng phương pháp đục lỗ khuếch tán trên đĩa thạch.
- Các giá trị cảm quan bao gồm: màu sắc của tôm, màu sắc của mắm tôm chua, mùi của mắm tôm chua, vị của mắm tôm chua.
- Các giá trị này được đo trên thang điểm 5, chi tiết được đo như bảng , phần phụ lục.
PHẦN IV
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN