chua.
Khả năng sinh acid lactic làm acid hóa môi trường là một trong hai đặc tính quan trọng nhất của VK lactic được chúng tôi quan tâm và tìm hiểu ở mức định tính và định lượng như sau:
Tìm hiểu định tính khả năng sinh acid lactic của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua (được tiến hành ở thí nghiệm 3.2.1).
Tìm hiểu định lượng lượng acid lactic được sinh ra từ VK lactic phân lập từ mắm tôm chua (được tiến hành ở thí nghiệm 3.2.2).
4.3.2.1. Thí nghiệm 3.2.1. Xác định định tính khả năng sinh acid lactic của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
Để tiến hành xác định định tính khả năng sinh acid lactic của 2 chủng NB1 và NB5, chúng tôi tiến hành thí nghiệm này theo 2 cách:
- Cách I: Sử dụng phương pháp cấy chấm khuẩn lạc của 2 chủng NB1 và NB5
trên môi trường thạch MRS có bổ sung CaCO3 0.05 %..
- Cách II: Sử dụng phương pháp khuếch tán trên lỗ thạch trên môi trường có cơ chất CaCO3.
Phân tích về môi trường phục vụ thí nghiệm này, chúng tôi đã tiến hành bổ sung thêm thành phần calcium carbonate với hàm lượng 0.05 % (khối lượng) đối với cả 2 môi trường. Sở dĩ bổ sung thêm CaCO3 vào môi trường vì trong quá trình nuôi cấy VK lactic có sự tạo thành acid lactic, CaCO3 sẽ tương tác với lượng acid sinh ra theo phản ứng axit – bazơ. Như vậy, lượng acid lactic sinh ra bao nhiêu sẽ làm tăng bán kính của vòng tròn hoạt tính (có màu trong) của VK bấy nhiêu. Quan trọng ở đây là hàm lượng CaCO3 được bổ sung vào môi trường với hàm lượng rất nhỏ – 0.05 %. Acid lactic là một acid yếu, với hàm lượng quá lớn CaCO3 trong môi trường, vòng tròn hoạt tính của VK lactic được biểu hiện không rõ ràng, khó xác định chính xác và so sánh hoạt tính sinh acid của VK.
Theo cách thứ nhất, chúng tôi sử dụng phương pháp cấy điểm 2 chủng NB1 và NB5 đã được hoạt hóa, môi trường sử dụng như đã đề cập ở trên là môi trường MRS có bổ sung CaCO3 (pH 6.5 ± 0.2; nuôi ở nhiệt độ 30 oC ± 2.0 oC). Tiến hành quan sát và theo dõi sự thay đổi trên đĩa thạch. Kết quả được chúng tôi ghi nhận ở bảng sau:
Bảng 4.6: Kết quả theo dõi sự hình thành vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic của 2 chủng NB1 và NB5
Chủng
Đặc điểm NB1 NB5
Đặc điểm chung
- VK phát triển tạo thành khuẩn lạc.
- Xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng tròn màu trong lan ra môi trường.
- Theo thời gian nuôi cấy (trong khoảng 24 – 48 giờ), khuẩn lạc tiếp tục phát triển, vòng tròn tiếp tục lan rộng ra môi trường làm trong phần môi trường bên trong nó.
Đặc điểm sai khác
- Màu sắc của khuẩn lạc
- Kích thước của bán kính vòng tròn hoạt tính sinh acid thay đổi theo thời gian
- Khuẩn lạc của chủng NB1 có màu trắng phớt vàng.
- Vòng tròn được tạo ra xung quanh khuẩn lạc có bán kính (D – d, mm) trung bình khoảng 3.5 – 3.6 (mm).
- Theo thời gian nuôi cấy, (trong vòng 24 – 72 giờ), bên cạnh việc khuẩn lạc tiếp tục phát triển, vòng tròn tiếp tục lan rộng ra môi trường, đạt bán kính (D – d, mm) trung bình khoảng 3.5 – 4.0 (mm)
- Khuẩn lạc của chủng NB5 có màu trắng đục.
- Vòng tròn được tạo ra xung quanh khuẩn lạc có bán kính (D – d, mm) trung bình khoảng 5.5 – 5.7 (mm).
- Theo thời gian nuôi cấy, (trong vòng 24 – 72 giờ), bên cạnh việc khuẩn lạc tiếp tục phát triển, vòng tròn tiếp tục lan rộng ra môi trường, đạt bán kính (D – d, mm) trung bình khoảng 5.5 – 6.0 (mm)
Hình 4.5: Vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic hình thành xung quanh khuẩn lạc chủng NB1
Hình 4.6: Vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic hình thành xung quanh khuẩn lạc chủng NB5
Như vậy, ta nhận thấy các chủng VK lactic khác nhau (mà ở đây là 2 chủng VK thuộc 2 loài Streptococcus – NB1 và loài Lactobacillus – NB5) có khả năng sinh acid lactic khác nhau. Dựa vào kích thước vòng tròn hoạt tính của 2 chủng, bước đầu chúng tôi nhận thấy chủng NB5 có khả năng sinh acid lactic lớn hơn chủng NB1 (xét ở cùng thời điểm nuôi cấy), cần tiếp tục tiến hành thí nghiệm khác để làm sáng tỏ luận điểm này. Mặt khác, do vòng tròn hoạt tính biến thiên theo thời gian nuôi cấy, vì thế mà xét về mặt thời gian, lượng acid lactic sinh ra ở các thời điểm khác nhau là khác nhau (xét
trong cùng 1 chủng, thời gian nuôi cấy từ 24 – 72 giờ).
Với những kết quả thu được từ cách I, chúng tôi tiếp tục tìm các luận cứ để đánh giá định tính khả năng sinh acid lactic của 2 chủng NB1 và NB5 bằng cách thay thế toàn bộ thành phần môi trường MRS bằng cơ chất CaCO3 (vẫn với tỷ lệ 0.05 % khối lượng) và agar (hàm lượng 20 g/l) vẫn giữ nguyên. Với môi trường thạch bổ sung CaCO3, chúng tôi sử dụng phương pháp khuếch tán trên lỗ thạch. Đồng thời, trong quá trình thực hiện, chúng tôi tiến hành đo pH của dịch nuôi cấy tại các thời điểm 24, 48, 72, 96 giờ nuôi cấy; mục đích nhằm xác định sự biến thiên của pH môi trường. Kết quả chúng tôi thu được như sau:
Bảng 4.7: Mức độ acid hóa môi trường của 2 chủng NB1 và NB5
Giờ 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ
D – dTB (mm) pHTB D – dTB (mm) pHTB D – dTB (mm) pHTB D – dTB (mm) pHTB NB1 3.2 4.49 3.9 4.12 4.4 3.64 5.1 4.30 NB5 2.9 4.51 4.3 4.04 5.1 3.45 4.6 4.09
Chú thích: D – d TB Bán kính vòng tròn hoạt tính được đo trung bình
Theo sự biến thiên pH của dịch nuôi cấy theo thời gian, ta thấy rằng pH của dịch nuôi cấy giảm dần theo thời gian từ 24 giờ – 72 giờ nuôi cấy, sau đó có xu hướng tăng lên sau 72 giờ nuôi cấy, đạt pH cực đại ở thời điểm 72 giờ nuôi cấy. Mặt khác, ta thấy chủng NB5 có khả năng làm thay đổi pH môi trường cao hơn chủng NB1 chứng tỏ chủng NB5 có khả năng sinh acid lactic mạnh hơn chủng NB1. Ta cần tiếp tục đối chiếu với kết quả của các thí nghiệm sau để hoàn thiện kết luận này.
Mặt khác, dựa vào sự thay đổi bán kính vòng tròn hoạt tính sinh acid (D – d, mm), ta thấy được những suy luận ở cách I là chính xác (xét một cách định tính và cảm quan). Điều đó có nghĩa là, xét trong cùng 1 chủng, điều kiện nuôi cấy như nhau, lượng acid lactic được sinh ra tăng dần theo thời gian trong khoảng 24 – 72 giờ; sau đó, lượng acid lactic có xu hướng giảm dần sau 72 giờ – từ 72 đến 96 giờ. Mặt khác, xét đối với 2 chủng NB1 và NB5, nuôi cấy cùng một điều kiện, chủng NB5 có khả năng sinh acid lactic cao hơn chủng NB1. Các kết luận này chỉ mang tính định tính, vì vậy cần phải tiến hành định lượng để có thể kết luận chính xác về khả năng sinh acid lactic của 2 chủng NB1 và NB5.
Hình 4.7: Vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic khuếch tán trên lỗ thạch của chủng NB1
Hình 4.8: Vòng tròn hoạt tính sinh acid lactic khuếch tán trên lỗ thạch của chủng NB5
Tổng kết lại những kết luận của thí nghiệm 3.2.1:
- Đối với từng chủng VK lactic, lượng acid lactic sinh ra ở các thời điểm khác nhau là khác nhau:
o Lượng acid lactic tăng dần theo thời gian từ 24 giờ đến 72 giờ và có xu hướng giảm dần sau 72 giờ.
o Lượng acid lactic sinh ra đạt cực đại trong khoảng thời gian từ 24 giờ đến 48 giờ.
- Chủng NB5 có khả năng sinh acid lactic cao hơn chủng NB1.
4.3.2.2. Thí nghiệm 3.2.2. Xác định định lượng khả năng sinh acid lactic của các chủng nghiên cứu.
Thí nghiệm này được thực hiện với mục đích định lượng tương đối lượng acid lactic được sinh ra bởi 2 chủng NB1 và NB5, từ đó để khẳng định và thống nhất những luận điểm của thí nghiệm 3.2.1 (đã định tính xác định). Để tiến hành thí nghiệm này, chúng tôi nuôi cấy 2 chủng NB1 và NB5 trên môi trường MRS lỏng, ở 30oC từ 24 – 96 giờ, sau đó xác định lượng acid lactic tạo thành theo phương pháp chuẩn độ Therner (0T). Kết quả sau khi chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.1 N như sau:
Bảng 4.8: Kết quả định lượng khả năng sinh acid lactic của 2 chủng NB1 và NB5
Thời gian Chủng NB1 Chủng NB5
24
giờ giờ48 giờ72 giờ96 giờ24 giờ48 giờ72 Giờ96 nTB (ml) 19.5 24.6 25.9 25.5 20.8 23.3 25.5 24.6
To
TB(ml) 195 246 259 255 208 233 255 246
A % TB
(g/100ml) 1.75 2.21 2.33 2.29 1.87 2.10 2.30 2.21
Chú thích: n (ml): Lượng NaOH 0.1 N đã dùng để trung hòa 100 ml dung dịch mẫu. To (ml): Lượng NaOH đã dùng để trung hòa 100 ml dung dịch mẫu. A % (g/100 ml mẫu): Lượng acid lactic trong 100 ml dung dịch mẫu
Dựa vào đường cong sinh trưởng của 2 chủng NB1 và NB5 đã được tìm hiểu ở thí nghiệm 3.1 cũng như quá trình tạo thành acid lactic của 2 chủng này, chúng tôi phân tích một vài điểm như sau:
Trong điều kiện lên men (ở đây là môi trường MRS dịch thể, pH ban đầu 6.5, to nuôi cấy ổn định 30 oC …), VK lactic sinh trưởng tăng sinh khối theo thời gian. Đồng thời, trong quá trình sinh trưởng, sản phẩm của chúng – acid lactic cũng được sinh ra, làm giảm dần dần pH của dịch lên men.
Khi sinh khối của VK lactic đạt ngưỡng cực đại thì sản phẩm acid lactic vẫn tiếp tục được tạo ra và đạt ngưỡng cực đại muộn hơn. Khi đó, pH của dịch nuôi cấy
mới đạt giá trị cực đại.
Sau quá trình ổn định và đạt giá trị cực đại, pH của dịch nuôi cấy sẽ tăng nhẹ. Sở dĩ như vậy có thể do:
o Môi trường hết các chất dinh dưỡng, nguồn cung cấp C cho VK lactic sinh trưởng hết, chúng sử dụng lại chính sản phẩm của mình là acid lactic làm thức ăn. Lượng acid lactic giảm dần trong dịch nuôi cấy làm pH tăng nhẹ.
o Ở điều kiện pH thấp (do acid lactic tạo ra) làm ức chế sự hoạt động của các vi sinh vật khác. Tuy nhiên, ở một giá trị nhất định nào đó thì pH cũng là một yếu tố có tác dụng ức chế ngược, kìm hãm chính sự sinh trưởng của VK lactic (bên cạnh các vi sinh vật khác).
o Sự xâm nhiễm của các vi sinh vật khác vào môi trường làm tăng pH của môi trường.
Như vậy, chúng tôi đã khái quát về khả năng sinh acid của VK lactic như sau: Lượng acid lactic sinh ra ở các thời điểm khác nhau là khác nhau. Lượng acid lactic tăng dần theo thời gian nuôi cấy từ 24 giờ đến 72 giờ và có xu hướng giảm dần từ 72 giờ trở đi, qua đó cho thấy lượng acid sinh ra đạt cực đại trong khoảng thời gian từ 48 giờ đến 72 giờ.
Ta thấy động học của quá trình sinh acid lactic ở 2 chủng VK lactic này khá giống với động học của quá trình sinh trưởng của chúng. Vì vậy, cần tìm hiểu và nghiên cứu kỹ hơn.
Tuy nhiên, với kết quả của thí nghiệm định lượng này, chúng tôi chưa thể chứng minh được chính xác chủng NB1 có khả năng sinh acid lactic cao hơn chủng NB5 hay không. Đề tài này chỉ sơ bộ xác định khả năng sinh acid lactic của 2 chủng, chưa cụ thể so sánh khả năng sinh acid lactic của 2 chủng này với nhau và với đối chứng.