Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu về VK lactic và các ứng dụng của chúng sử dụng trong công nghệ thực phẩm vẫn còn khá mới mẻ. Chủ yếu, các nghiên cứu được công bố chủ yếu chỉ dừng ở việc phân lập, tuyển chọn và đánh giá các chủng VK lactic từ những nguồn mẫu như: nem chua, sữa chua…
Người ta đã phân lập và tuyển chọn thành công 2 giống Streptococcus. sp và
Lactobacillus. sp từ chế phẩm Probiotic. 2 chủng này đều là là VK gram dương (+), không có khả năng di động, không có hoạt tính catalase, có khả năng đồng hóa các loại đường. 2 chủng này có hoạt tính sinh acid lactic mạnh, có khả năng chịu mặn ở độ mặn 5 % [8], [18].
Ở một công bố khác, người ta đã phân lập được 50 chủng VK lactic từ nguồn mẫu ở địa bàn TP. Hà Nội, đã lựa chọn được 10 chủng VK mang nhiều đặc điểm của
chi Lactobacillus. 10 chủng tuyển chọn đều sinh acid lactic cao (trên 200 oT), hoạt tính ức chế Vk tốt, khả năng phân giải protein mạnh [30].
Mặt khác, nhằm ứng dụng lên men lactic trong sản xuất chế phẩm probiotic, người ta đã phân lập và tuyển chọn được 3 chủng VK lactic thuộc chi Lactobacillus có hoạt tính sinh acid lactic cao, sinh trưởng tốt trên môi trường cải tiến rẻ tiền, có thể thay thế cho môi trường MRS nhiều hóa chất đắt tiền, khó kiếm [8], [22].
Với ứng dụng lên men lactic trong sản xuất bột cá nhạt, người ta đã xác định được một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng Lactobacillus. sp. Đây là một trực khuẩn, không sinh bào tử, không có khả năng chuyển động, lên men lactic đồng hình. Đồng thời, người ta đã tìm được môi trường cải tiến, có tính kinh tế hơn, trong đó thay thế môi trường MRS bằng nước mắm, nước bắp cải, đường và peptone [20].
PHẦN III
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- VK lactic tham gia quá trình lên men lactic trong mắm tôm chua. - VSV chỉ thị:
Chủng Bacillus sp. Chủng E. Coli
Chủng Salmonella sp. Chủng Pseudomonas sp. Chủng Staphylococcus “trắng” Chủng Staphylococcus “vàng”
3.1.2. Hóa chất
Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng tôi đã sử dụng nhiều loại hóa chất khác nhau. Nhìn chung, chúng được chia làm các nhóm chính như sau:
Nhóm hóa chất pha môi trường:
o Agar (Việt Nam).
o Calcium carbonate – CaCO3 (Trung Quốc).
o Nutrient Agar (Đức).
o Dipotassium hydrogen phosphate – K2HPO4 (Trung Quốc).
o Meat extract – Cao thịt (Đức).
o Yeast extract – Cao nấm men (Đức).
o Triamomonium citrate – (NH4)3C6H5O7 (Trung Quốc).
o Magnesium sulfate heptahydrate – MgSO4 . 7 H2O (Trung Quốc).
o Mangan sulfate tetrahydrate – MnSO4 . 4 H2O (Đức).
o Peptone (Trung Quốc).
o Saccharose – C12H22O11 (Việt Nam).
o Sodium acetate anhydrous – CH3COONa (Trung Quốc).
o Sodium chloride – NaCl (Trung Quốc).
o Tween 80 (Trung Quốc). Nhóm hóa chất nhuộm:
o Phenic acid: C6H6O.
o Lugol: I2 + KI.
o Tím gential.
o Fucxin.
Nhóm hóa chất khác:
o Sodium hydroxide – NaOH (Trung Quốc).
o Hydrogen chloride – HCl (Trung Quốc).
3.1.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
Trong quá trình thực tập tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện tại nhiều phòng thí nghiệm khác nhau. Mỗi phòng thí nghiệm được trang bị những dụng cụ, thiết bị hiện đại khác nhau. Những thiết bị được chúng tôi sử dụng bao gồm:
Máy khuấy từ gia nhiệt – ARE Italia.
Cân phân tích Mettler Toledo – FB 602 S/FACT. Cân kỹ thuật Mettler Toledo – AB 204 S/FACT. Máy đo quang phổ – LIUV 310S.
Tủ nuôi ổn nhiệt JSR – JSRI 150C. Máy đo pH bàn – pH Meter S20. Máy đo pH cầm tay – pH Meter SG2. Tủ sấy dụng cụ JSR – OF 100.
Máy ly tâm lạnh – Hettich Model 320. Kính hiển vi Leica – ADM 750.
Lò vi sóng Sanyo – EMG 4777S. Nồi hấp.
Tủ lạnh thường Panasonic.
V..v…
Bên cạnh đó, chúng tôi cũng sử dụng những dụng cụ thí nghiệm cơ bản như sau:
Eppendorf Research các loại: 0.1 – 2.5 µl; 0.5 – 10 µl; 2 – 20 µl; 10 – 100 µl; 1000 – 5000 µl …
Ống nghiệm. Đĩa Petri.
Dụng cụ bằng thủy tinh khác: Đèn cồn, các loại cốc thủy tinh (ứng với các mức thể tích), các loại bình cầu đáy bằng và tròn (ứng với các mức thể tích), các loại bình tam giác (ứng với các mức thể tích), các loại ống đong (ứng với các mức thể tích), ống hút.
Que cấy bao gồm: que cấy thẳng, que cấy vòng, que cấy tam giác.
3.1.4. Môi trường cơ bản sử dụng cho nghiên cứu
Trong quá trình thực tập tốt nghiệp, chúng tôi đã thực hiện tại nhiều phòng thí nghiệm khác nhau, trên nhiều lĩnh vực khác nhau (như hóa học, sinh học VSV thực phẩm, sinh học VSV thú y …). Chính vì vậy, môi trường được sử dụng trong các thí nghiệm là rất nhiều để phục vụ mục đích của từng thí nghiệm. Tổng hợp những môi trường (bao gồm thành phần môi trường) được sử dụng trong đề tài này gồm có:
Môi trường LB: Peptone
Cao nấm men NaCl Agar 10 g/l 5 g/l 8 g/l 20 g/l pH 7.0 ± 0.2 Môi trường MRS: Peptone Cao thịt Cao nấm men Glucose
Tri – ammonium citrate
Magnesium sulfate heptahydrate Sodium acetate anhydrous
10 g/l 10 g/l 5 g/l 20 g/l 2 g/l 0.2 g/l 5 g/l
Dipotassium hydrogen phosphate Mangan sulfate tetrahydrate Tween 80 Agar 2 g/l 0.05 g/l 1 ml/l 20 g/l pH 6.5 ± 0.2
Chú ý: Tùy từng thí nghiệm mà chúng tôi không bổ sung Agar (môi trường lỏng), bổ sung CaCO3 với hàm lượng 0.05 % khối lượng (xác định khả năng sinh acid), hoặc thay thế glucose bằng saccharose, maltose, galactose (xác định khả năng đồng hóa các loại đường).
Môi trường thạch đá vôi: Agar
Calcium carbonate
20 g/l 0.05 % pH 7.0 ± 0.2
Môi trường thạch dinh dưỡng: Peptone Meat extract Sodium chloride Agar 5.0 g/l 2.0 g/l 1.0 g/l 20 g/l pH 7.0 ± 0.2
3.2. Địa điểm nghiên cứu
Trong toàn bộ quá trình thực tập, chúng tôi đã tiến hành tất cả các thí nghiệm tại các phòng thí nghiệm sau:
Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học, ĐH Nông nghiệp Hà Nội.
Phòng thí nghiệm Công nghệ Môi trường – Khoa Tài nguyên & Môi trường, ĐH Nông nghiệp Hà Nội.
Phòng thí nghiệm BM. Vi sinh vật & Truyền nhiễm – Khoa Thú Y, ĐH Nông nghiệp Hà Nội.
Phòng thí nghiệm BM. Di truyền giống – Khoa Chăn nuôi Thú y, ĐH Nông nghiệp Hà Nội.
3.3. Thời gian nghiên cứu: 15/02/2010 – 31/07/2010.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Các thí nghiệm
3.4.1.1. Thí nghiệm 1.1: Phân lập các chủng VK trên môi trường MRS dựa theo khả năng sinh acid lactic.
a. Mẫu thu thập
- Mắm tôm chua Thái Bình. - Mắm tôm chua Huế. - Mắm cà dầm tôm. b. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch MRS, môi trường MRS dịch thể. - Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri, ống nghiệm. c. Chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sinh trưởng trên môi trường MRS. - Sự biến thiên pH của dịch nuôi cấy VK.
- Nhận biết sự có mặt của acid lactic trong dịch nuôi cấy VK.
3.4.1.2. Thí nghiệm 2.1: Tìm hiểu đặc điểm hình thái học khuẩn lạc của VK có khả năng sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch MRS. - Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC. - Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đổi kích thước trung bình khuẩn lạc theo thời gian. - Sự thay đổi hình dạng khuẩn lạc theo thời gian..
- Sự thay đổi màu sắc khuẩn lạc theo thời gian.. - Đặc điểm khuẩn lạc theo thời gian.
3.4.1.3. Thí nghiệm 2.2: Tìm hiểu đặc điểm hình thái học tế bào của VK có khả năng sinh acid lactic được phân lập.
- Nhuộm Gram và tiến hành soi mẫu trên kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Xác định Gram của VK.
- Xác định hình dạng, kích thước của VK.
3.4.1.4. Thí nghiệm 2.3: Tìm hiểu hoạt tính catalase của VK có khả năng sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy khuẩn lạc: môi trường thạch MRS.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC, thời gian nuôi cấy t = 48 (h). - Hóa chất thử hoạt tính catalase: Nước oxy già (H2O2).
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bề mặt khuẩn lạc. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Quan sát hiện tượng trên bề mặt khuẩn lạc sau khi nhỏ hóa chất thử hoạt tính bằng mắt thường.
- Quan sát hiện tượng trên bề mặt khuẩn lạc sau khi nhỏ hóa chất thử hoạt tính bằng kính hiển vi.
3.4.1.5. Thí nghiệm 2.4: Tìm hiểu kiểu lên men của VK có khả năng sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC, thời gian nuôi cấy t = 24 (h). - Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự biến thiên pH của dịch lên men theo thời gian. - Sự thay đổi trong ống Dunham.
3.4.1.6. Thí nghiệm 2.5: Tìm hiểu hoạt tính protease của VK có khả năng sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường thử hoạt tính protease. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sinh protease của VK lactic.
3.4.1.7. Thí nghiệm 2.6: Tìm hiểu khả năng đồng hóa các loại đường của VK sinh acid lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Đường phục vụ nghiên cứu: glucose, saccharose, maltose, galactose.
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể có bổ sung thành phần đường khác nhau.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC, thời gian nuôi cấy t = 24 (h).
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên ống nghiệm. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự biến thiên pH dịch lên men theo thời gian.
- Xác định sự tồn tại của acid lactic trong dịch lên men.
3.4.1.8. Thí nghiệm 3.1: Xác định đường cong sinh trưởng của VK lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể. - Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC. - Đo OD620 nm của dịch nuôi cấy theo thời gian. - Số lần nhắc lại: 3 lần trên bình nuôi cấy. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đổi giá trị OD620 nm theo thời gian.
3.4.1.9. Thí nghiệm 3.2.1: Xác định định tính khả năng sinh acid lactic của VK lactic được phân lập.
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch MRS có bổ sung CaCO3 0.05 %. - Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự sinh trưởng của khuẩn lạc của VK theo thời gian đo bằng độ đục OD ở bước sóng 620 nm.
- Sự thay đổi của vòng tròn hoạt tính xung quanh khuẩn lạc theo thời gian. - Sự biến thiên của bán kính vòng tròn hoạt tính (D – d, mm) theo thời gian.
3.4.1.10. Thí nghiệm 3.2.2: Xác định định lượng khả năng sinh acid lactic của VK lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS lỏng. - Điều kiện nuôi cấy: pH 6.5 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC.
- Số lần nhắc lại: 3 lần theo phương pháp trung hòa NaOH. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Lượng (ml) NaOH 0.1 N trung bình đã sử dụng để trung hòa 100 (ml) dung dịch mẫu.
- Lượng acid lactic (g/100 ml mẫu) có trong mẫu.
3.4.1.11. Thí nghiệm 3.3: Xác định khả năng sinh bacterioxin của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch LB, môi trường thạch dinh dưỡng. - Điều kiện nuôi cấy: pH 7.0 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC (đối với môi trường LB), 37 ± 2.0oC (đối với môi trường thạch dinh dưỡng).
- VSV chỉ thị: Bacillus sp.; Pseudomonas sp.; E. Coli; Salmonella sp.; Staphylococcus “trắng”; Staphylococcus “vàng”.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên đĩa Petri. b. Chỉ tiêu theo dõi
3.4.1.12. Thí nghiệm 3.4: Tìm hiểu ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến sự sinh trưởng của VK lactic được phân lập.
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS lỏng.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.0 ± 0.2, các điều kiện nhiệt độ khác nhau. - Đo OD620 nm của dịch nuôi cấy theo thời gian.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bình nuôi cấy. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Khả năng sinh trưởng bằng đo độ đục trên máy so màu OD620 (bước sóng 620 nm, kính lọc màu đỏ).
3.4.1.13. Thí nghiệm 3.5: Tìm hiểu ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường MRS dịch thể có bổ sung NaCl ở các nồng độ khác nhau.
- Điều kiện nuôi cấy: pH 6.0 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC .
- Đo OD620 nm của dịch nuôi cấy theo thời gian để xác định khả năng sinh trưởng.
- Số lần nhắc lại: 3 lần trên bình nuôi cấy. b. Chỉ tiêu theo dõi sinh trưởng
- Sự thay đổi giá trị OD620 nm theo thời gian.
3.4.1.14. Thí nghiệm 4.1: Tìm hiểu tác dụng kháng khuẩn đơn loài của VK lactic phân lập từ mắm tôm chua
a. Bố trí thí nghiệm
- Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch LB, môi trường thạch dinh dưỡng. - Điều kiện nuôi cấy: pH 7.0 ± 0.2, to 30 ± 2.0 oC (đối với môi trường LB), 37 ± 2.0oC (đối với môi trường thạch dinh dưỡng).
- VSV chỉ thị: Bacillus sp.; Pseudomonas sp.; E. Coli; Salmonella sp.; Staphylococcus “trắng”; Staphylococcus “vàng”.
b. Chỉ tiêu theo dõi
- Kích thước bán kính vòng tròn kháng khuẩn (D – d, mm) đối với từng chủng.
3.4.1.15. Thí nghiệm 5.1: Tìm hiểu sự thay đổi các giá trị cảm quan của mắm tôm chua trong quá trình sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm
a. Bố trí thí nghiệm
- Lên men mắm tôm chua theo 2 phương pháp: truyền thống và bổ sung dịch nuôi cấy VK.
- Đánh giá các chỉ tiêu định kỳ 5 ngày / 1 lần kiểm tra. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đổi pH của mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiêu màu sắc tôm theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiêu độ dai tôm theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiêu màu sắc mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiêu màu mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiệu vị mắm tôm chua theo thời gian.
3.4.1.16. Thí nghiệm 5.2: Tìm hiểu phương pháp làm mắm tôm chua cải tiến trên quy mô phòng thí nghiệm
a. Bố trí thí nghiệm
- Lên men mắm tôm chua theo phương pháp cải tiến có bổ sung dịch nuôi cấy VK.
- Đánh giá các chỉ tiêu định kỳ 3 ngày / 1 lần kiểm tra. b. Chỉ tiêu theo dõi
- Sự thay đổi pH của mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiêu màu sắc tôm theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiêu độ dai tôm theo thời gian.
- Sự thay đổi chỉ tiêu màu sắc mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiêu màu mắm tôm chua theo thời gian. - Sự thay đổi chỉ tiệu vị mắm tôm chua theo thời gian.
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu