- Xóa dấu in (Erasure)
6.3.2. Nguyên tắc của PCR
PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase để khếch đại in vitro các đoạn DNA đặc trưng. Taq polymerase là enzyme chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn
DNA mới trong môi trường có 4 loại deoxyribonucleotic (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ số lượng DNA được nhân lên nhiều lần, nhờ vậy có đủ số lượng để tách ra phân tích trình tự hoặc tạo dòng. Primer ở bên trái tác động trên sợi DNA 3’-5’ được gọi là primer thuận (ký hiệu là F), primer ở bên phải tác động trên sợi DNA 5’-3’ được gọi là primer ngược (ký hiệu là R). Từ chu kỳ thứ 2 polymerase bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác định. Nếu biết trình tự của trình tự của đoạn gene cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thuật điện di.
PCR thường tiến hành khoảng 25-35 chu kỳ, một chu kỳ nhiệt bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ. Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn, giai đoạn nhiệt độ này gọi là giai đoạn biến tính. Kế đó nhiệt độ sẽ được hạ xuống 55-65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt độ này gọi là giai đoạn bắt cặp. Cuối cùng nhiệt độ được đưa lên 72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để
kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung. Như vậy qua chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao, và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao.