D. Ứng dụng của PCR
c. Nguyên tắc máy đếm tế bào
Máy đếm tế bào phân tích lượng lớn tế bào đơn. Thiết bị gồm một hệ thống thủy động học áp lực, chùm laser, mặt phẳng chặn tia laser/dòng tế bào, một chuỗi máy dò ánh sáng và bộ phân tích số liệu. Q trình thu nhận số liệu như sau:
- Tế bào được nhuộm bằng thuốc tế bào (huỳnh quang), cho dòng tế bào đi vào máy đếm và chảy theo ống nhỏ có lỗ chỉ cho lần lượt 1 tế bào đi qua. Dòng tế bào này đi qua vùng có tia laser để kích hoạt phẩm nhuộm huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang được tiếp nhận bởi hệ thống máy vi tính để phân tích tín hiệu từ đó tính được số lượng tế bào.
192 - Sau khi nhuộm các tế bào có thể tích điện tích khác nhau trên bề mặt tế bào nên có thể dùng từ trường điện để tách các loại tế bào riêng biệt (Trần Thị Dân, 2005).
Hình 3.13. Nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào
http://meds.queensu.ca/qcri/flow/cri-fc-getstarted.htm
3.2.2.3. Kỹ thuật ELISA (Enzymee-linked immunosorbent assay)
Theo Charlier J. và ctv (2005), có thể dùng kỹ thuật ELISA để chẩn đoán phát hiện bệnh viêm vú trên bò sữa.
Trong kỹ thuật ELISA người ta sử dụng enzyme đánh dấu thay thế cho chất đồng vị phóng xạ. ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện nay ELISA được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp đặc biệt là trong kiểm tra an toàn các sản phẩm sinh học.
a. Nguyên lý
Theo Nguyễn Ngọc Hải (2007), một số enzyme như alkaline phosphatase hay peroxidase có thể gắn kết với kháng thể một cách khơng đặc hiệu, các enzyme này có thể nhận biết nhờ vào phản ứng của chúng với cơ chất tương ứng, nhờ vậy có thể thơng qua những enzyme nói trên để phát hiện các kháng thể gắn kết với chúng. Hoạt tính xúc tác của enzyme sẽ giải phóng oxy nguyên tử từ H2O2, oxy này oxy hóa chất chỉ thị màu, làm thay đổi màu của hỗn dịch. Chất chỉ thị màu thay đổi là chứng minh sự có mặt của enzyme và sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể. Như vậy, kỹ thuật ELISA gồm 3 thành phần tham gia phản ứng:
193 - Kháng nguyên: thường được gắn sẵn trên giá. Hiện nay người ta thường sử dụng loại giá là đĩa ELISA 96 giếng.
- Kháng thể cần xác định trong huyết thanh. - Conjugate là phức hợp có gắn chất chỉ thị màu. Kỹ thuật này bao gồm hai bước:
- Phản ứng miễn dịch học: sự kết hợp kháng nguyên kháng thể.
- Phản ứng hóa học: nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng oxy ngun tử và chính oxy ngun tử này oxy hóa chất chỉ thị màu. Chất chỉ thị thay đổi màu có nghĩa là chứng minh sự có mặt của enzyme và chứng minh sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể.
b. Phân loại
Có nhiều loại kỹ thuật ELISA dùng trong chẩn đoán: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, ELISA cạnh tranh,…
Hình 3.14. Các bước trong Sandwich ELISA
(http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/ELISA)
Giải thích: (1) Phủ đĩa bằng KT; (2) Thêm mẫu cần xác định KN. KN (nếu có) sẽ gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme. KT thứ cấp sẽ gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được.
+ Kỹ thuật ELISA trực tiếp
Kháng nguyên được gắn vào đáy giếng phản ứng sau đó phủ lên trên kháng thể đặc hiệu gắn enzyme và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Sau khi rửa để loại bỏ những kháng thể gắn enzyme (conjugate) không kết hợp với kháng nguyên và cho vào giếng chất hiện màu. Đọc kết quả sau 10 phút trên quang phổ kế.
Có thể đọc kết quả theo hai trường hợp như sau:
+ Nếu kháng ngun đặc hiệu với kháng thể thì sẽ có sự kết hợp kháng nguyên và kháng thể gắn enzyme (conjugate) khơng bị rửa trơi, trong giếng có sự hiện diện của enzyme. Enzyme sẽ giải phóng oxy nguyên tử từ H2O2 (cho vào cùng chất hiện màu) để oxy hóa chất hiện màu làm thay đổi màu của hỗn dịch trong giếng.
194 + Nếu kháng ngun khơng đặc hiệu với kháng thể thì sẽ khơng xảy ra sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể, conjugate bị rửa trơi và trong giếng khơng có enzyme để giải phóng oxy nguyên tử từ H2O2 oxy hóa chất hiện màu kết quả là hỗn dịch trong giếng phản ứng không thay đổi màu.
Hình 3.15. Kỹ thuật ELISA trực tiếp
(http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1194)
+ Kỹ thuật gián tiếp
Về ngun tắc thì kỹ thuật gián tiếp khơng khác so với kỹ thuật trực tiếp nhưng kỹ thuật gián tiếp có tăng thêm một bước phản ứng. Conjugate trong kỹ thuật trực tiếp là kháng thể đặc hiệu gắn enzyme, trong khi đó conjugate của phản ứng gián tiếp là kháng thể khác lồi kháng lại kháng thể có mặt trong huyết thanh cần chẩn đốn.
Với phản ứng gián tiếp thì kháng thể đặc hiệu có hai chức năng: một là kháng thể đối với kháng nguyên, hai là kháng nguyên đối với conjugate. Khi đọc kết quả cũng có hai trường hợp xảy ra, tương tự như kỹ thuật ELISA trực tiếp: phản ứng dương tính nếu màu của hỗn dịch thay đổi và ngược lại phản ứng là âm tính khi màu hỗn dịch không thay đổi.
Hình 3.16. Kỹ thuật ELISA gián tiếp
http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1194
195
Hình 3.17. Kỹ thuật ELISA cạnh tranh
http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1194
Trong ELISA cạnh tranh, conjugate là kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên được gắn trên bề mặt giếng. Do đó có sự cạnh tranh giữa kháng thể trong huyết thanh và conjugate trong quá trình gắn kết với kháng nguyên để hình thành phức hợp kháng nguyên- kháng thể, kháng nguyên- conjugate. Phức hợp kháng nguyên- kháng thể ít hơn phức hợp kháng nguyên- conjugate sẽ có màu đậm hơn so với môi trường hoặc ngược lại. Tùy vào mức độ đậm nhạt của màu (được đánh giá bằng tỷ số chênh OD ở ánh sáng có độ dài sóng thích hợp) mà người ta có thể xác định là dương tính, âm tính hay nghi ngờ.