- Xóa dấu in (Erasure)
KỸ THUẬT TẠO THÚ BIẾN ĐỔI GENE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN PHẨM THUỐC VÀ Y SINH HỌC
7.2.3. Chuyển gene vào động vật
Hiện nay có nhiều phương pháp khác chuyển gene nhau đang được sử dụng để tạo động vật chuyển gene: vi tiêm, chuyển gene bằng cách sử dụng các tế bào gốc phôi, chuyển gene bằng cách sử dụng vector virus, súng bắn gene, tiêm trực tiếp…
2.2.3.1. Phương pháp vi tiêm
Khó khăn cần khắc phục trong chuyển gene bằng vi tiêm đó là phải loại bỏ màng chorion. Có thể loại bỏ màng này bằng cách dùng enzyme, có thể là trypsin hay proteinase. Hoặc dùng thủ công bằng tay, tức là sử dụng một mũi kim sắc nhọn xé rách màng.
Hình 7.6. Máy vi thao tác
Máy vi thao tác gồm 2 phần giống hệt nhau được bố trí hai bên kính hiển vi, một dùng để điều chỉnh kim tiêm, một dùng cho kim giữ. Tính năng của máy này là cho phép điều chỉnh các kim theo khơng gian 3 chiều.
Hình 7.5. Trứng tiền nhân
(http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/3 56950)
141
Vi tiêm được tiến hành qua các bước:
Nạp gene vào kim tiêm bằng phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gene khoảng 10-12 giờ) hoặc bơm trực tiếp dung dịch gene vào.
Lắp kim tiêm và kim giữ vào máy vi thao tác.
Chuyển trứng tiền nhân vào đĩa petri có chứa mơi trường được đặt dưới kính hiển vi.
Điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi và điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí của trứng tiền nhân.
Khi thấy trứng tiền nhân hơi phồng to và trở nên sáng hơn thì dừng lại và kéo nhanh kim tiêm ra.
Hình 7.7. Kỹ thuật bơm tinh trùng vào bào tương trứng
7.2.3.2. Phương pháp xung điện
Một dòng điện cao áp trong khoảnh khắc có khả năng tạo ra các lỗ thủng trên màng tế bào khiến DNA ngoại lai từ mơi trường có thể xâm nhập vào trong tế bào. Bằng phương pháp này hiệu quả biến nạp khá cao và chuyển được cả các gene có kích thước lớn.
Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời trên màng bào chất Máy xung điện
142
7.2.3.3. Phương pháp tiêm trực tiếp
Chuyển gene bằng tiêm trực tiếp DNA ngoại lai vào tế bào sinh dưỡng
7.2.3.4. Phương pháp lây nhiễm retrovirus
Retrovirus mang hệ gene RNA có thể chuyển thành DNA nhờ enzyme phiên mã ngược của chính virus đó. Khi xâm nhập vào tế bào chủ, hệ gene virus sẽ xen vào hệ gene của tế bào chủ.
7.2.3.5. Sử dụng súng bắn gene
Súng bắn gene (Genee gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và được phát triển vào đầu thập niên 1980. Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọc DNA. Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gene là hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system).
143 Nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tốc các hạt.
7.2.3.6. Sử dụng tế bào gốc phôi
Từ túi phôi, người ta tách ra các tế bào gốc phơi. Bên cạnh đó, chuẩn bị gene cần chuyển và biến nạp vào tế bào gốc phôi với số lượng lớn. Sau đó chuyển các tế bào gốc phôi đã biến nạp vào túi phôi nhận và mang đi cấy ghép sinh ra thế hệ sau mang gene biến nạp.
Hình 7.8: Tạo động vật chuyển gen bằng tế bào gốc phơi
144
7.2.3.7. Đóng gói DNA ngoại lai trong liposome chuyển vào tế bào trứng hay phôi
Trước tiên ta cần chuẩn bị plasmid đã được gắn gene cần chuyển. Sau đó đóng gói vào liposome sẽ tạo ra phức hệ plasmid-liposome. Tiếp theo cho phức hợp này nhiễm vào tế bào đích (TB cần cải biến gene) thường là trứng hay phôi. Khi vào trong, gene được cải biến sẽ hoạt động.