Tất cả các chỉ số nghiên cứu được ghi chép vào phiếu điều tra nghiên cứu (Phụ lục II) bao gồm:
2.2.5.1. Phương pháp thu thập đặc điểm đối tượng
Khai thác trực tiếp từ bệnh nhân và từ phần thăm khám chuyên khoa trong bệnh án.
2.2.5.2. Phương pháp xác định các chỉ số máu ngoại vi
a) Các chỉ số: HC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, BC, TC
Được xác định trên máy CELLDYLL 1800 tại Khoa Huyết học - Truyền máu - Bệnh viện Phụ sản Trung ương:
* Nguyên lý đếm các tế bào máu ngoại vi:
- Đếm các tế bào HC, BC, TC: máy đếm tự động xác định giá trị về lượng HC, BC, TC theo phương pháp trở kháng đã được chuẩn hoá để đếm và sắp xếp tế bào theo kích thước.
Một điện trường được tạo ra qua một lỗ nhỏ, ở đó các tế bào máu được huyền phù hoá trong dung dịch hoà loãng đẳng trương đi qua. Các tế bào riêng biệt đi qua lỗ nhỏ này gây tăng trở kháng của dòng điện trực tiếp và sự tăng trỏ kháng này tỷ lệ với thể tích của chúng.
- Xác định HGB theo phương pháp cyanmethemoglobin
Nồng độ HGB được đo bởi độ hấp phụ quang học khi đi qua buồng đếm hồng cầu. Khi HGB được giải phóng khỏi hồng cầu nó bị biến đổi thành cyanmethemoglobin.
Kaliferrcyanid
Hemoglobin (Fe2+) Methemoglobin
Methemoglobin (Fe3+) Cyanmethemoglobin Độ hấp phụ quang học của chất này được đọc ở bước sóng 540 nm. Phép đo cyanmethemoglobin được so sánh với sự quy chiếu 0 đạt được từ phép đo sự hấp phụ tiến hành trước khi thử nghiệm khi buồng đếm hồng cầu chứa đầy dung dịch hoà loãng.
- Xác định HCT, MCH, MCHC, MCV: máy xác định theo chương trình cài đặt sẵn của máy.
* Mẫu xét nghiệm: 1ml máu tĩnh mạch được chống đông bằng EDTA. Xét nghiệm được thực hiện trong vòng 2 giờ sau khi lấy máu. Các mẫu xét nghiệm đều được lấy khi bệnh nhân chưa được điều trị trong vòng 1 - 2 ngày đầu vào viện.
Hình 2.1. Máy CELLDYLL 1800 b) Hồng cầu lưới
* Nguyên lý: HC lưới là giai đoạn trung gian giữa HC có nhân và HC trưởng thành, chúng được sinh từ tủy xương rồi vào hệ tuần hoàn. Sau 24 - 48 giờ, HC lưới trở thành hồng cầu trưởng thành. Hình ảnh mạng lưới là những tàn dư ARN riboxom được bắt màu bởi thuốc nhuộm đặc biệt bleu - cresyl.
* Mẫu xét nghiệm: lấy 4 giọt máu tĩnh mạch được chống đông bằng EDTA. Xét nghiệm được thực hiện trong vòng 2 giờ sau khi lấy máu. Các
mẫu xét nghiệm đều được lấy khi bệnh nhân chưa được điều trị trong vòng 1 - 2 ngày đầu vào viện.
* Tiến hành: lấy 4 giọt máu tĩnh mạch được chống đông bằng EDTA trộn đều với 2 giọt dung dịch xanh sáng cresyl ủ ở 37oC trong 15 - 20 phút rồi làm tiêu bản máu dàn, để khô tự nhiên và đọc dưới kính hiển vi vật kính 100. Tính tỷ lệ phần trăm (%) HC lưới trong 1000 HC trưởng thành.
2.2.5.3. Phương pháp xác định chỉ số protein niệu
Được xác định bằng thanh giấy thử 10 thông số thực hiện trên máy phân tích nước tiểu bán tự động CLINITEX ADVANTUS tại Khoa Hóa sinh- Bệnh viện Phụ sản Trung ương.
* Nguyên lý: trên thanh giấy thử, ở vùng phản ứng với protein có chứa hỗn hợp dung dịch đệm và chỉ thị màu khi pH hằng định. Nếu có protein, nó sẽ chuyển màu từ vàng sang xanh ve nhạt rồi đậm. Nếu kết quả trên thanh giấy thử từ (+++) trở lên tương ứng với 3g/l trở lên thì cần định lượng protein lại. Sử dụng phương pháp định lượng protein bằng phương pháp soi độ đục, dùng acid tricloacetic 5% để kết tủa protein, soi độ đục bằng quang kế, sau đó nhân với hệ số bằng cách vẽ biểu đồ mẫu để tính lượng protein niệu.
* Mẫu xét nghiệm: nước tiểu được lấy vào buổi sáng khi PNCT ngủ dậy, đựng trong lọ vô khuẩn. Xét nghiệm được thực hiện trong vòng 30 phút sau khi lấy nước tiểu. Các mẫu xét nghiệm đều được lấy khi bệnh nhân chưa được điều trị trong vòng 1 - 2 ngày đầu vào viện.
Hình 2.2. Máy phân tích nước tiểu bán tự động CLINITEX ADVANTUS
2.2.5.4. Phương pháp xác định các chỉ số cytokin
a) Định lượng erythropoietin
Được xác định trên hệ thống hóa phát quang miễn dịch IMMULITE 2000 tại Khoa Hóa sinh - Viện Huyết học Truyền máu Trung ương với bộ sinh phẩm của hãng Siemens
* Nguyên lý của kỹ thuật hóa phát quang miễn dịch: dựa trên nguyên lý sandwich pha rắn, các hạt nhựa được phủ các kháng thể kháng cytokin (EPO) được ủ với huyết thanh của mẫu cần định lượng cytokin (EPO) hình thành phức hợp kháng thể - cytokin. Phức hợp này sẽ được gắn với kháng thể thứ hai có gắn alkaline phosphatase tạo phức hợp kháng thể - cytokin - kháng thể gắn alkaline phosphatase. Sau khi loại bỏ các phần không được gắn vào phức hợp bởi các chu trình rửa, phức hợp này được phát hiện bằng cơ chất dioxetane. Khi cơ chất dioxetane phản ứng với alkaline phosphatase sẽ tạo ra ánh sáng. Lượng ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ cytokin cần định lượng. Các tia sáng sẽ được thu và khuếch đại vào các ống nhận quang. Sau khi đối chiếu với đường cong chuẩn sẽ tính ra nồng độ cytokin cần định lượng.
* Các bước định lượng EPO trên hệ thống hóa phát quang miễn dịch IMMULITE 2000
- Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất:
+ Hệ thống hóa phát quang miễn dịch IMMULITE 2000. + Bộ kit EPO của hãng Siemens.
+ Dụng cụ labo thường quy: barcode, cóng đo chuyên dụng, eppendorf, pipet...
+ Mẫu xét nghiệm: 2ml máu tĩnh mạch không chống đông lấy huyết thanh bảo quản ở tủ lạnh sâu -70oC đến khi tiến hành xét nghiệm.
- Quy trình xét nghiệm: hoàn toàn tự động trên hệ thống + Khởi động hệ thống, nạp hóa chất.
+ Lấy 50µl huyết thanh cho vào cóng đo chuyên dụng. + Đặt cóng đo vào khay xét nghiệm.
+ Chạy phần mềm định lượng EPO.
+ Kết quả hiển thị trên màn hình hệ thống.
Hình 2.3. Hệ thống IMMULITE 2000 b) Định lượng GM-CSF
Được xác định dựa trên phương pháp miễn dịch gắn enzym ELISA dạng sandwich với bộ sinh phẩm của hãng Cusabio biotech, đọc mật độ quang
bằng hệ thống BECKMAN COULTER DTX 880 Multimode detector tại Labo Miễn dịch, Labo Vi sinh vật và mầm bệnh - Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Sinh y dược học - Học viện Quân y.
* Nguyên lý chung của phương pháp ELISA: là dùng kháng nguyên hoặc kháng thể đánh dấu để phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể qua chất chỉ thị mầu.
* Quy trình chung của phương pháp ELISA: - Nhỏ mẫu và chứng - Ủ và rửa - Nhỏ cộng hợp - Ủ và rửa - Nhỏ dung dịch cơ chất - Ủ
- Dừng phản ứng và đọc: Tại máy đọc, sự biến đổi màu sắc của cơ chất khi bị thủy phân qua đèn soi được lọc thành ánh sáng đơn sắc. Máy hấp phụ quang và chuyển thành mật độ quang (OD - Optical density) sau đó so sánh với đồ thị chuẩn để xác định lượng kháng nguyên.
* Nguyên lý của hệ thống hóa BECKMAN COULTER DTX 880 Multimode detector: dựa trên nguyên lý sandwich pha rắn, ở đáy giếng của phiến định lượng cytokin được phủ các kháng thể kháng cytokin (GM-CSF)
Kháng thể đánh dấu
Kháng nguyên cần phát hiện
được ủ với huyết thanh của mẫu cần định lượng cytokin hình thành phức hợp kháng thể - cytokin. Phức hợp này sẽ được gắn với kháng thể thứ hai có gắn horseradish peroxydase (HRP) tạo phức hợp kháng thể - cytokin - kháng thể gắn HRP. Sau khi loại bỏ các phần không được gắn vào phức hợp bởi các chu trình rửa, phức hợp này được phát hiện bằng cơ chất TMB (3, 3’, 5, 5’ - tetremethylbenzydine). Khi cơ chất TMB phản ứng với HRP sẽ biến đổi màu phức hợp. Tại máy đọc, sự biến đổi màu sắc của cơ chất khi bị thủy phân qua đèn soi được lọc thành ánh sáng đơn sắc. Máy hấp phụ quang và chuyển thành mật độ quang (OD - Optical density) sau đó so sánh với đồ thị chuẩn để xác định lượng nồng độ cytokin cần định lượng.
* Các bước định lượng GM-CSF trên hệ thống BECKMAN COULTER DTX 880 Multimode detector
- Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất:
+ Hệ thống BECKMAN COULTER DTX 880 + Bộ kit GM-CSF của hãng Cusabio biotech. + Dụng cụ labo thường quy: eppendorf, pipet...
+ Mẫu xét nghiệm: 2ml máu tĩnh mạch không chống đông lấy huyết thanh bảo quản ở tủ lạnh sâu -70oC đến khi tiến hành xét nghiệm.
- Quy trình xét nghiệm:
+ Dụng cụ, hóa chất, sinh phẩm được đưa về nhiệt độ phòng. + Pha chuẩn GM-CSF, pha kháng thể gắn Biotin, pha cộng hợp HRP - avidin theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit.
+ Rã đông huyết thanh bệnh nhân. + Các bước tiến hành.
Thêm 100µl mẫu và chuẩn đã pha loãng vào các giếng phù hợp. Dán kín giếng, ủ ở nhiệt độ 370C/2 giờ. Đổ hết dịch ở mỗi giếng, không rửa.
Thêm 100µl kháng thể gắn biotin vào mỗi giếng.
Dán kín giếng, ủ 1 giờ ở nhiệt độ 370C. Rửa 3 lần với dung dịch rửa.
Thêm 100µl cộng hợp HRP - avidin vào mỗi giếng. Dán kín giếng, ủ 1 giờ ở nhiệt độ 370C. Rửa 5 lần với dung dịch rửa
Thêm 50µl dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution) vào mỗi giếng Đọc kết quả ở bước sóng 450nm
Hình 2.4. Hệ thống BECKMAN COULTER DTX 880 Multimode detector
c) Định lượng IL-4, IL-6, IL-10, TNFα
Được xác định dựa trên phương pháp miễn dịch gắn enzym ELISA dạng sandwich với bộ sinh phẩm của hãng Orgenium, đọc mật độ quang bằng hệ thống BECKMAN COULTER DTX 880 Multimode detector tại Labo Miễn dịch, Labo Vi sinh vật và mầm bệnh - Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Sinh y dược học - Học viện Quân y.
Nguyên lý, quy trình tiến hành định lượng các cytokin này tương tự như định lượng GM-CSF. Sự khác nhau trong định lượng các cytokin này là thể tích hóa chất, thời gian ủ, số lần rửa. Thể tích hóa chất, thời gian ủ, số lần rửa được tiến hành tuân theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit.