Miễn dịch phóng xạ PAG được thực hiện theo phương pháp của Zoli và cộng sự (1992) [181] có cải tiến để phù hợp với ứng dụng trên các mẫu của
trâu đầm lầy (bảng 2.3). Trước hết, cho vào mỗi ống phân tích 0,1 ml đệm
Tris-BSA đối với phương pháp có ủ trước kháng thể và 0,2 ml đối với phương pháp không ủ trước kháng thể. Tiếp theo, thêm 0,1 ml PAG chuẩn vào các ống chuẩn. Đối với phương pháp không ủ trước kháng thể, thêm 0,05 ml các
loại mẫu khác nhau vào các ống phân tích. Đối phương pháp có ủ trước kháng thể, thêm 0,1 ml các loại mẫu khác nhau vào các ống phân tích. Sau đó, thêm 0,1 ml kháng thể thứ nhất vào tất cả các ống, trừ ống đối chứng âm. Đối với
phương pháp có ủ trước kháng thể, thêm 0,1 ml 125I-PAG đã được đánh dấu
phóng xạ vào tất cả các ống. Các mẫu phân tích và ống chuẩn được ủ qua đêm
ở nhiệt độ phịng. Ngày hơm sau, đối với phương pháp không ủ trước kháng
thể thêm 0,1ml 125I-PAG đánh dấu phóng xạ vào tất cả các ống và ủ tiếp 4 giờ
các ống và ủ tiếp 30 phút ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng thêm vào tất cả các ống 2,0 ml đệm Tris-BSA và ly tâm 20 phút với 1500 vòng/phút. Sau khi ly tâm, loại bỏ phần dịch nổi và đếm phóng xạ nhờ máy đếm gamma (Wallac, 1261
Multigamma, Ferkin Elmer, Life sciences).
Bảng 2.3. Phương pháp RIA có và khơng ủ trước với kháng thể Bước và hố chất Có ủ trước Khơng ủ trước
Đệm Tris-BSA (µl) 100 200 Mẫu (µl) 100 50 Đường chuẩn (ng/ml) 0,225 0,8100 PAG* (µl) 100 Kháng thể (µl) 100 100 Ủ qua đêm x X PAG* (µl) 100 Ủ 4 giờ X PEG (ml) 1 1 Ủ 30 phút x X Đệm Tris BSA (ml) 2 2 Ly tâm 3500 g, 20 phút, 10 0C 3500 g, 20 phút, 10 0C Đếm phóng xạ Đo ở mức 60 giây