Phương pháp ELISA kẹp gián tiếp (Indirect sandwich ELISA) là phương pháp dùng các kháng thể để bắt giữ kháng nguyên PAG trong các
giếng của đĩa ELISA 96 lỗ và dùng huyết thanh thỏ kháng PAG để gắn vào
1µg/100µl huyết thanh thỏ kháng PAG (đã tinh sạch) được ủ trong các giếng
chứa 0,1 M NaCO3; pH 9,6 qua đêm ở 40C. Đảo ngược các đĩa và đổ dung
dịch vào khăn giấy sạch để loại bỏ dung dịch thừa. Thêm 0,25 ml dung dịch cố định (0,2 % BSA trong 0,5 M Na3PO4, pH 7,5) vào mỗi giếng, ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dung dịch cố định bằng cách rửa 3 lần với 300 µl
dung dịch rửa (0,9 % NaCL, 0,1 % Tween 20) nhờ máy rửa đĩa ELISA 8 kênh (Nunc-Immuno™ Washers). Tiếp theo, thêm 0,1 ml các loại mẫu từ trâu có chửa hoặc các dung dịch chuẩn PAG đã được pha loãng (trong dung dịch đệm). Đối với 2 giếng đối chứng âm, thêm vào mỗi giếng 0,1 ml dung dịch đệm, ủ 1 giờ ở 370C. Sau đó, tiến hành rửa 3 lần bằng 0,3 ml dung dịch rửa. Thêm 0,1 ml IgG gắn Biotin vào mỗi giếng, ủ tiếp 1 giờ ở 370C. Sau đó, tiếp tục rửa 3 lần bằng 0,3 ml dung dịch rửa được rửa và thêm 0,1 ml Avidine
(Pierce Biotechnology, Inc; pha loãng theo tỷ lệ 1: 25.000) vào các giếng ủ
tiếp 20 phút ở 370C. Rửa bỏ và thêm 0,15 ml TMB (Pierce Biotechnology, Inc) ủ trong vòng từ 20 đến 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Thêm 0,05 ml H2SO4 để dừng phản ứng. Đọc đĩa ELISA bằng mày EL800 ở bước
Đường chuẩn trong phương pháp Elisa được chuẩn bị thành tám điểm
gồm một điểm đối chứng âm và bảy điểm PAG chuẩn. Nồng độ PAG chuẩn được chuẩn bị theo phương pháp pha loãng 2 lần thành các nồng độ 0,015;
0,03; 0,62; 1,25; 2,5; 5 và 10 ng/ml. Ở mỗi đĩa ELISA đều có đường chuẩn và giá trị thực của mẫu được tính tốn dựa theo phương pháp hồi quy tuyến tính từ điểm tới điểm (ng/ml PAG) so với chỉ số hấp thụ (OD) bằng cách sử dụng phần mềm Kjunor (Bio-Teck instruments. INC).