) Dài thân chéo Chu vi ngực
3.3.1. Tối ưu phương pháp sandwich ELISA
Nhằm tối ưu phương pháp ELISA, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra ảnh hưởng của các yếu tố như khả năng gắn kết của kháng thể, hàm lượng kháng thể trong bước gắn kháng thể vào đĩa Elisa và độ pha loãng của dung dịch
biotin và avidin. Kết quả kiểm tra này được phân tích dựa vào giá trị biểu hiện của các kháng thể khác nhau.
Hình 3.27 thể hiện hình ảnh kết quả hiện màu của đĩa ELISA pha loãng kháng thể kháng PAG bò (As#726) khi cho dừng phản ứng sau ủ 30 phút. Ba kháng thể (As#859, As#726 and As#706) đã được kiểm tra độ pha loãng tối
ưu cho gắn đĩa. Các kháng thể có độ pha lỗng thích hợp biến động từ
1/64.000 tới 1/128.000 tương ứng với ba loại kháng thể trên với đường chuẩn sử dụng là 5 ng/ml và 10 ng/ml.
Hình 3.27. Đĩa ELISA kiểm tra độ pha loãng của kháng thể kháng PAG dê (As#726) (dừng phản ứng sau 30 phút) Hàm lượng PAG (ng/ml) Đường chuẩn (y = Ax + B) A = 0,1406; B = 0,0480, R2 = 0,9984) Đ ộ h ấ p th ụ ( O D )
Đường chuẩn của phương pháp ELISA được mô tả ở hình 2.28.
Chương trình tạo đường chuẩn Kjunior (Bio-Teck instruments. INC) hiển thị theo dạng điểm nối điểm, với đường nối dạng phương trình y = aX + b. Các
điểm chuẩn PAG được pha theo các nồng độ: 0; 0,15; 0,3; 0,6; 1,25; 2,5; 5,0,
và 10,0 ng/ml. Trong các lần thí nghiệm, hệ số tương quan giữa độ hấp thụ và hàm lượng PAG trong đường chuẩn đều rất cao. Giá trị của độ hấp thụ (OD) của đường chuẩn giao động từ 0,1 tới 1,5, giá trị độ hấp thụ này là tối ưu cho phương pháp ELISA.
Giá trị của độ hấp thụ trong nghiên cứu thử nghiệm độ pha lỗng của biotine và avidine được trình bày trong bảng 3.23. Trong nghiên cứu này đĩa ELISA được gắn kháng thể và sử dụng PAG chuẩn với hàm lượng 10 ng/ml. Giá trị OD của đối chứng âm (NSB) giao động từ 0,215 tới 0,333 và giá trị
OD trong các giếng chứa PAG chuẩn từ 1,04 tới 2,081. Theo Green và cộng sự (2005) [66] đường chuẩn PAG có thể được biểu diễn bằng dạng hình xich ma và hầu hết có sự tác động qua lại giữa kháng nguyên và kháng thể (hình 3.29).
Hình 3.29. Đường chuẩn phương pháp ELISA theo Green và cs.[66]
Đ ộ h ấ p th ụ ( O D )
Trong nghiên cứu xác định tính tương đồng của PAG chuẩn với mẫu
vật trong phương pháp ELISA, Green và cộng sự đã sử dụng một dãy pha
loãng của mẫu huyết tương bị mang thai giai đoạn muộn (hình 3.29). Các tác giả đã khảo sát hai đường chuẩn, đường chuẩn 1 được khảo sát với mẫu pha
lỗng của bị số 656 và số 25 trên cùng một đĩa ELISA và đường chuẩn 2 với mẫu còn lại được pha loãng trên một đĩa ELISA khác [66].
Plikaytis và cộng sự (1991) [121] đã phân tích khả năng sử dụng bốn dạng đường chuẩn khác nhau để đánh giá kết quả định lượng cùng một loại
mẫu khi sử dụng phương pháp ELISA. Các tác giả nhận thấy kết quả hệ số tương quan (R2) và hàm lượng mẫu khác nhau khi sử dụng phương pháp tính tốn khác nhau. Tuy nhiên với các mẫu đối chứng đã biết trước hàm lượng,
nếu chỉ dựa hệ số R2 để kết luận về tính tối ưu và giá trị của hàm lượng mẫu
được dùng để định lượng có thể dẫn đến nhận định sai về tình trạng tối ưu và độ chính xác của đường chuẩn. Sai số có thể xẩy ra trong q trình tính tốn
dẫn đến sự sai khác giữa kết quả thu được so với hàm lượng thực của mẫu.
Kết quả nghiên cứu của Plikaytis và cộng sự (1991) [121] cho thấy, phương pháp áp dụng đường chuẩn dạng logistic-log là phương thức tối ưu đối với mơ hình đường chuẩn trong xác định độ chính xác và hàm lượng mẫu. Ngược lại trong nghiên cứu mình sau khi đã tiến hành khảo sát và đánh giá kết quả theo chương trình xử lý của Kjunior, chúng tôi nhận thấy phương pháp điểm nối điểm, đồng thời sử dụng phương trình bậc nhất cho hệ số tương quan và độ
chính xác tối ưu của mơ hình đường chuẩn (hình 3.28).
Trong nghiên cứu của chúng tôi, đường chuẩn thể hiện tương quan giữa
độ hấp thụ (OD) và hàm lượng PAG chuẩn được biểu thị bằng đường thẳng
(hình 3.29). Để đánh giá độ chính xác của giá trị định lượng chúng tơi đã tiến hành định lượng các mẫu chuẩn PAG đã biết chính xác hàm lượng và so sánh
tiến hành đồng thời với hai giếng trong mỗi lần phân tích. Theo Green và
cộng sự (2005)[66], phương pháp này cho phép tránh được những sai số trong q trình tính tốn chuyển từ dạng OD sang dạng Log.
Bảng 3.22. Giá trị OD trong thử nghiệm độ pha loảng của biotine và avidine Avidin (dung dịch gốc 1/100) Độ pha loãng 1/100 1/150 1/200 1/250 1/6000 0.,333 0,282 0,297 0,215 NSB 1/10000 0,330 0,324 0,233 0,216 1,831 1,639 1,389 1,277 2,021 1,651 1,417 1,272 1/6000 1,789 1,546 1,357 1,305 1,638 1,295 1,132 1,040 1,642 1,304 1,162 1,099 Biotin 1/10000 1,666 1,431 1,218 1,045 Dựa vào kết quả của giá trị OD, chúng tôi nhận thấy điều kiện tối ưu
trong các bước gắn kháng thể và pha hoá chất là: (1) tỷ lệ pha loãng của kháng thể dùng để gắn đĩa ELISA giao động từ 1/64.000 (As#706 và As#859) tới 1/128.000 (As#726), tỷ lệ này tương đương với hàm lượng kháng thể
1mg/ml; (2) tỷ lệ pha loãng của biotin từ dung dịch gốc biotin-kháng thể là 1/10.000; (3) hàm lượng avidin được pha theo tỷ lệ 1/25.000 từ dung dịch gốc 1 mg/ml.