1.3. ĐÁNH GIÁ ĐỊNH LƢỢNG NGUY CƠ VI SINH VẬ T CÁCH TIẾP CẬN
1.3.2.2. Vai trò của đánh giá nguy cơ đối với cơ sở sản xuất thực phẩm
Đánh giá nguy cơ cũng có thể giúp các cơ sở sản xuất thực phẩm xây dựng kế hoạch cho hệ thống phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn (HACCP- hazard analysis critical control points) hiệu quả hơn hay có cơ sở khoa học trong xây dựng kế hoạch HACCP. Thí dụ, nhà sản xuất có thể dùng kết quả đánh giá nguy cơ để nhận ra các mối nguy mà nếu nhƣ khơng có giải pháp can thiệp thì mối nguy này sẽ trở thành nguy cơ có thật trên sức khỏe con ngƣời [31].
1.3.2.3. Vai trò của đánh giá nguy cơ đối với thương mại toàn cầu
Các hiệp ƣớc thƣơng mại toàn cầu đƣợc xây dựng bởi WTO nhấn mạnh sự cần thiết của các điều lệ, đƣợc xây dựng dựa trên phƣơng pháp đánh giá nguy cơ một cách khoa học, đối với thực phẩm thƣơng mại trên toàn cầu. Hiệp ƣớc về Hiệp định kiểm dịch động thực vật (SPS Agreement) đặt phƣơng pháp đánh giá nguy cơ vào hệ thống kiểm sốt an tồn vệ sinh thực phẩm để phát triển một bộ tiêu chuẩn an toàn thực phẩm trên thị trƣờng thƣơng mại toàn cầu. Dựa trên đánh giá nguy cơ, Hiệp ƣớc này đã đƣa ra các quy định quan trọng để đảm bảo an toàn thực phẩm đối với các nƣớc thành viên WTO [31].
1.3.3. Các khái niệm cơ bản trong đánh giá nguy cơ an toàn thực phẩm Mối nguy (hazard): là yếu tố sinh học, hóa học hoặc vật lý có thể làm cho Mối nguy (hazard): là yếu tố sinh học, hóa học hoặc vật lý có thể làm cho
thực phẩm khơng an tồn khi sử dụng. Mối nguy thực phẩm có thể là sự hƣ hỏng tự thân (do các q trình hóa lý) của thực phẩm hoặc mầm bệnh có sẵn trong nó hay bị ơ nhiễm từ bên ngoài vào. Mối nguy là tác nhân có thể gây bệnh, gây hại nhƣng cũng có thể khơng nếu đƣợc phịng tránh tốt [31, 79].
Nguy cơ (Risk): là khả năng xảy ra các ảnh hƣởng bất lợi lên sức khỏe và độ
nghiêm trọng của các ảnh hƣởng đó liên quan đến một mối nguy khi có sự phơi nhiễm. Nói cách khác, nguy cơ là khả năng (mức độ) xảy ra một ảnh hƣởng bất lợi lên sức khỏe nhiều hay ít, nặng hay nhẹ [31] .
Nguy cơ (risk) = mối nguy (hazard) + phơi nhiễm (exposure)
Đánh giá nguy cơ (risk assessment): là một quá trình khoa học sử dụng các
thử nghiệm, quan sát và nghiên cứu nhằm nhận định và phân loại các mối nguy gây nên nguy cơ; xác định bản chất và mức độ nguy cơ của chúng [31] .
Đánh giá nguy cơ gồm bốn bƣớc chính: (i)Xác định (nhận dạng) mối nguy; (ii) mơ tả mối nguy (bao gồm phân tích liều- đáp ứng); (iii) đánh giá phơi nhiễm và (iv) mơ tả nguy cơ
Hình 1.10: Các bƣớc đánh giá nguy cơ [164]
1.3.4. Phân loại đánh giá nguy cơ vi sinh vật
Với các nguy cơ liên quan đến vi sinh vật, có hai hình thức đánh giá nguy cơ cơ bản là: đánh giá nguy cơ định lƣợng và đánh giá nguy cơ định tính.
Đánh giá nguy cơ định lƣợng: là đánh giá nguy cơ mà chỉ ra nguy cơ ở dạng số liệu và các chỉ số về những sự không đảm bảo liên quan.
Đánh giá nguy cơ định tính: là đánh giá nguy cơ dựa trên dữ liệu, trong khi cơ sở ƣớc tính số lƣợng mối nguy khơng đầy đủ: tuy nhiên, khi đƣợc các chuyên gia có kiến thức chun mơn phán quyết và nhận biết độ khơng đảm bảo thì nguy cơ có thể đƣợc phân loại hoặc tách thành các nhóm nguy cơ (thấp, trung bình và cao) [79].
Hình 1.11: Phân loại đánh giá nguy cơ vi sinh vật [79].
1 3 5 Phƣơng pháp nhận dạng mối nguy trong đánh giá nguy cơ vi sinh vật trong thực phẩm
Nhận dạng mối nguy vi sinh vật là nhận biết các vi sinh vật hoặc các độc tố vi sinh trong thực phẩm liên quan. Các mối nguy có thể đƣợc xác định từ các nguồn dữ liệu liên quan. Thơng tin về mối nguy có thể thu đƣợc từ các tài liệu khoa học, từ cơ sở của nghành công nghiệp thực phẩm, các cơ quan quản lý và các tổ chức có liên quan và thơng qua lấy ý kiến của các chuyên gia. Thông tin liên quan bao gồm các dữ liệu trong các lĩnh vực nhƣ: nghiên cứu lâm sàng, nghiên cứu dịch tễ và điều tra, nghiên cứu động vật trong phịng thí nghiệm, điều tra các đặc tính của vi sinh vật, sự tƣơng tác giữa vi sinh vật và môi trƣờng thông qua chuỗi thực phẩm từ sản xuất ban đầu đến tiêu dùng và các nghiên cứu vi sinh vật và các tình huống tƣơng tự [8]. Vì vậy, việc nhận dạng mối nguy trong đánh giá nguy cơ vi sinh vật đƣợc thực hiện thông qua việc thu thập tài liệu liên quan, rồi phân tích và tổng hợp thơng tin từ các tài liệu đó.
1 3 6 Phƣơng pháp mô tả mối nguy trong đánh giá nguy cơ vi sinh vật
Tính chất của mô tả mối nguy là thiết lập một mối quan hệ liều đáp ứng lý tƣởng. Khi thiết lập một mối quan hệ tƣơng quan, cần xem xét đến các điểm kết thúc khác nhau nhƣ lây nhiễm hoặc bệnh tật. Khi chƣa biết đƣợc mối quan hệ liều đáp ứng,
cần sử dụng các công cụ đánh giá nguy cơ nhƣ dùng tƣ vấn của chuyên gia để xem xét các yếu tố khác nhau, mức độ lây nhiễm để mô tả các đặc trƣng của mối nguy [79].
Nhƣ vậy, phƣơng pháp thực hiện việc mô tả mối nguy là dựa trên đánh giá liều đáp ứng. Đánh giá liều- đáp ứng là sự đo lƣờng cho ƣớc tính nguy cơ, bao gồm ƣớc tính đáp ứng với nguy cơ nhiễm trùng, nguy cơ mắc bệnh hoặc nguy cơ tử vong đối với một liều lƣợng của vi sinh vật gây bệnh đã biết. Cơ sở của đánh giá liều - đáp ứng là mơ hình liều- đáp ứng xuất phát từ các thuật tốn để mơ tả mối quan hệ liều- đáp ứng cho các tác nhân gây bệnh cụ thể [31]. Về cơ bản, liều- đáp ứng là một đƣờng cong mô tả mối quan hệ giữa liều và đáp ứng.
Hình 1.12: Đƣờng cong mơ tả mối quan hệ liều và đáp ứng [152]
Mơ hình liều-đáp ứng mơ tả xác suất của một đáp ứng cụ thể từ khi phơi nhiễm với một tác nhân gây bệnh cụ thể ở một quần thể cụ thể, nhƣ là một hàm số của liều. Hàm số này dựa trên số liệu thực nghiệm. Việc sử dụng các mơ hình tốn học là cần thiết bởi vì trƣớc hết, ơ nhiễm thực phẩm thƣờng xảy ra với số lƣợng thấp hoặc xảy ra với các tình huống phơi nhiễm thực tế. Tác nhân gây bệnh trong thực phẩm thƣờng không phải ngẫu nhiên phân tán, mà thƣờng tồn tại ở dạng các khối riêng biệt hoặc các cụm, cần phải đƣợc đƣa vào tính tốn khi ƣớc tính nguy cơ
sức khỏe. Thêm nữa, cỡ mẫu nhóm thử nghiệm có giới hạn, và vì vậy các mơ hình là cần thiết, ngay cả trong các thí nghiệm kiểm sốt tốt, để phân biệt sự thay đổi ngẫu nhiên với các hiệu ứng sinh học thật [31].
Có 2 mơ hình cơ bản là mơ hình hàm số mũ (Exponential model) và mơ hình Beta-Poisson (Bảng 1.3) thƣờng đƣợc sử dụng để xây dựng mối quan hệ liều- đáp ứng trong đánh giá định lƣợng nguy cơ vi sinh vật trong thực phẩm và nƣớc [129].
Bảng 1.3: So sánh mơ hình hàm số mũ và hàm Beta-Poisson Mơ hình hàm số mũ Mơ hình Beta- Poisson Mơ hình hàm số mũ Mơ hình Beta- Poisson Áp dụng Pinf= 1- e-rμ
Pinf: là xác suất nhiễm trùng
r: hệ số lây nhiễm đặc trƣng cho từng loại vi sinh vật cụ thể
μ: nồng độ trung bình tác nhân gây bệnh (dose)
Pinf= 1-(1+ μ/β)-α khi β≥1 vàα ≤1.
α; β: là hệ số lây nhiễm cố định và đặc trƣng cho mỗi mối nguy vi sinh vật
Ƣu điểm Đơn giản, áp dụng khi các vi sinh vật phân bố ngẫu nhiên và coi xác suất nhiễm trùng cho bất kì vi sinh vật nào là r.
Khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của mơ hình hàm số mũ, khi
r giả định là khác nhau theo
một phân bố beta. Nhƣợc
điểm
Các tác động thực tế khơng hồn tồn thỏa mãn vì giữa sự biến đổi nhiễm trùng trong các mầm bệnh và sự thay đổi giữa các vật chủ trong tính nhạy cảm bị bỏ qua
Phức tạp hơn
1 3 7 Các phƣơng pháp dùng trong đánh giá phơi nhiễm S. aureus
Đánh giá phơi nhiễm bao gồm đánh giá về mức độ phơi nhiễm ƣớc tính hoặc đánh giá thực tế ở ngƣời. Đối với tác nhân vi sinh, đánh giá phơi nhiễm có thể dựa vào khả năng nhiễm bẩn thực phẩm từ một tác nhân cụ thể hoặc độc tố của nó và dựa trên thông tin dinh dƣỡng. Đánh giá phơi nhiễm cần xác định rõ lƣợng thực phẩm quan tâm.
Các yếu tố phải đƣợc xem xét đối với đánh giá phơi nhiễm bao gồm tần suất nhiễm bẩn thực phẩm do tác nhân gây bệnh gây ra và mức độ có mặt của tác nhân có trong các loại thực phẩm này theo thời gian. Yếu tố khác cần đƣợc xem xét trong đánh giá là các mơ hình tiêu thụ, vai trị của ngƣời chế biến thực phẩm (nguồn gây nhiễm), sự tiếp xúc bằng tay với sản phẩm và các tác động của thời gian/ nhiệt độ môi trƣờng [8].
1.3.7.1. Phương pháp định lượng S. aureus trong các đối tượng mẫu thu thập trong chuỗi cung ứng thực phẩm
Để đánh giá định lƣợng nguy cơ vi sinh vật thì việc định lƣợng mật độ vi sinh vật trong thực phẩm đóng vai trị quan trọng, giúp tính đƣợc liều nhiễm bệnh trong các bƣớc mơ tả nguy cơ.
Với S. aureus, việc định lƣợng trong thực phẩm có nhiều phƣơng pháp khác nhau dựa trên các môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc. TCVN 4830-1:2005 là phƣơng pháp tiêu chuẩn quốc gia đƣợc biên soạn dựa trên tiêu chuẩn quốc tế ISO 6888- 1:1999 đã đƣợc thẩm định trên các nền mẫu thực phẩm và cho độ tin cậy cao khi áp dụng để định lƣợng S. aureus [3]. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng để định lƣợng tụ cầu có phản ứng dƣơng tính với coagulase trên đĩa thạch có mặt trong thực phẩm bằng cách đếm số khuẩn lạc thu đƣợc trên môi trƣờng đặc (môi trƣờng Bair-Parker) sau khi ủ trong điều kiện hiếu khí ở 35oC hoặc 37 o
C.
1.3.7.2. Phương pháp nhận dạng bằng sinh học phân tử: phương pháp PCR phân tích gen coagulase và gen sinh độc tố
Với ƣu điểm là nhanh và độ nhạy cao, phƣơng pháp PCR đƣợc sử dụng phổ biến để phát hiện nhiều mối nguy vi sinh vật trong thực phẩm. Đối với mối nguy S.
aureus, phƣơng pháp PCR giúp xác định nhanh và nhạy các chủng S. aureus chứa
gen sinh độc tố nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm [70] và gen coa đặc trƣng của
S. aureus [160]. Nhiều tác giả trên thế giới đã sử dụng phƣơng pháp này để phát
hiện hơn 20 loại gen sinh độc tố ruột (Staphylococcal enterotoxin), gen giống độc tố ruột và gen coa trên các loại thực phẩm khác nhau góp phần tìm ngun nhân gây
Jinghua Cheng [76]...Bằng việc sử dụng phƣơng pháp PCR, Jamaira Fereira Veras và cộng sự đã phát hiện đƣợc gen coa của 07 chủng tụ cầu trong khi phƣơng pháp
thử nghiệm sinh hóa truyền thống khơng phát hiện đƣợc [160].
1.3.7.3. Phương pháp PFGE phân tích sự nhiễm chéo và truy suất nguồn gốc lây nhiễm S. aureus trong thực phẩm
Kỹ thuật điện di trƣờng xung PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) là phƣơng pháp điện di trong trƣờng điện thay đổi. PFGE là tiêu chuẩn vàng trong phân loại học phân tử và có ứng dụng quan trọng trong các chƣơng trình giám sát và kiểm sốt dịch bệnh nhƣ các bệnh nhiễm trùng bệnh viện, xâm lấn, hô hấp cũng nhƣ truy xuất nguồn gốc sự ô nhiễm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật [103]. PFGE đƣợc mô tả lần đầu tiên năm 1984 để phân tách các đoạn DNA kích thƣớc lớn bằng enzym endonucleases. Ban đầu PFGE đƣợc sử dụng để so sánh các chủng thu đƣợc trong suốt các cuộc giám sát dịch bệnh để đánh giá sự liên quan giữa các vụ dịch bệnh để đƣa ra cảnh báo cho cộng đồng. Năm 1996, Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh của Mỹ (CDC) đã sử dụng PFGE phân loại phân tử ở cấp độ quốc gia để giám sát ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật [103].
Ƣu điểm của phƣơng pháp: Trong khi các phƣơng pháp phân loại dƣới loài khác đỏi hỏi sự phát triển đặc hiệu nhân tố đích thì quy trình làm PFGE cơ bản giống nhau và có thể sử dụng đƣợc cho hầu hết các sinh vật có thể ni cấy. Phƣơng pháp này đã đƣợc chuẩn hóa, có độ tái lặp, độ ổn định và phù hợp với nghiên cứu dịch tễ học nói chung [103].
Cho đến nay, phƣơng pháp PFGE đƣợc coi nhƣ là một tiêu chuẩn vàng để so sánh khi phân tích "vân tay" (fingerprinting) genome của các vi khuẩn gây bệnh. Nó cho khả năng phân biệt tƣơng đƣơng hoặc mạnh hơn so với các phƣơng pháp định týp khác. Hơn nữa, PFGE cũng cho kết quả nhìn thấy bằng mắt thƣờng, khơng cần sử dụng đến Southern blot và không cần các đầu dò DNA, RNA. Khác với ribotyping, PFGE có thể kiểm tra tồn bộ gen khi cần thiết, vì thế mức phân biệt đặc hiệu chủng sẽ lớn hơn. PFGE là phƣơng pháp hữu hiệu hơn RFLP trong việc phân tích mối quan hệ ở mức độ lồi và dƣới loài [121].
Hạn chế khi sử dụng PFGE: Cần nhiều thời gian để phân tích (5-6 ngày) và chi phí phân tích đắt do giá của hóa chất sử dụng cao. Hơn nữa, việc thực hiện phƣơng pháp này đòi hỏi nhân viên đƣợc đào tạo đặc biệt và thiết bị tinh vi [121].
Trên thế giới phƣơng pháp PFGE đã đƣợc áp dụng rộng rãi trong phân tích S.
aureus và tỏ ra là một cơng cụ hữu ích và vƣợt trội so với các phƣơng pháp khác,
đặc biệt trong việc giúp diễn giải mối quan hệ về loài giữa các chủng S. aureus
[144]. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu sử dụng PFGE để điều tra dịch tễ học phân tử [27, 38, 46] nhƣng hiện chƣa có tác giả nào sử dụng phƣơng pháp PFGE để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các chủng S. aureus phân lập đƣợc ở thực
phẩm cũng nhƣ trên các đối tƣợng trong bếp ăn tập thể các trƣờng học.
1.3.7.4. Phương pháp điều tra khẩu phần
Đánh giá phơi nhiễm là việc đánh giá lƣợng mầm bệnh ăn vào theo thực phẩm sau khi đã tìm đƣợc liều - đáp ứng (gây bệnh) [31].
Để xác định đƣợc lƣợng thực phẩm tiêu thụ, phƣơng pháp điều tra khẩu phần cần đƣợc tiến hành. Hiện nay có nhiều phƣơng pháp điều tra khẩu phần nhƣ phƣơng pháp ghi sổ và kiểm kê, phƣơng pháp cân đong, phƣơng pháp ghi chép, phƣơng pháp hỏi ghi 24 giờ qua, phƣơng pháp điều tra tần suất thực phẩm, phƣơng pháp hỏi tiền sử dinh dƣỡng…[32]
Việc lựa chọn phƣơng pháp điều tra khẩu phần phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu. Đối với điều tra khẩu phần từng cá thể riêng rẽ thì phƣơng pháp ghi chép (nhật ký), phƣơng pháp hỏi ghi 24 giờ qua thƣờng đƣợc áp dụng. Đối với điều tra khẩu phần ở bếp ăn tập thể thì phƣơng pháp ghi sổ và kiểm kê, phƣơng pháp cân đong thƣờng đƣợc áp dụng [32]. Trong nghiên cứ của chúng tơi, với mục đích xác định đƣợc lƣợng thực phẩm học sinh ăn tại trƣờng, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp kiểm tra hồ sơ xuất nhập thực phẩm kết hợp phƣơng pháp cân đong thực phẩm tại bếp ăn ở các giai đoạn trƣớc và sau khi làm sạch, nấu chín, sau khi ăn cịn lại [32].
1.3.7.5. Phương pháp mô phỏng Monte Carlo
Mơ phỏng Monte Carlo là một phân tích mở rộng các trƣờng hợp có thể xảy ra. Nó là một mơ hình tốn học đƣợc xây dựng để mô tả con đƣờng đánh giá phơi nhiễm, bao gồm tất cả các biến có thể ảnh hƣởng đến sự phơi nhiễm. Thơng thƣờng,
nó sẽ có dạng một loạt các phƣơng trình tốn học đƣợc kết hợp. Kết quả của sự kết hợp này là sự biểu hiện phơi nhiễm của ngƣời tiêu thụ. Mơ hình đƣợc viết thành phần mềm mô phỏng Monte Carlo, cho phép ngƣời đánh giá dễ dàng xác định phân phối xác suất, thay vì các giá trị rời rạc cho mỗi biến.
Phần mềm đánh giá mơ hình bằng cách chọn ngẫu nhiên một giá trị cho mỗi biến từ phân phối đặc trƣng. Xác suất của bất kỳ giá trị nào đƣợc chọn đều phù hợp