Quy trình chi tiết nhƣ sau [72, 103]:
Bƣớc 1: Cấy vi khuẩn
Chủng S. aureus cấy trên đĩa thạch Nutrient agar/thạch máu cừu 5%, sau đó lấy 1 khuẩn lạc cấy chuyển tiếp tạo khuẩn lạc thuần (lấy khuẩn lạc tƣơi <18 giờ)
Hòa tan trong TE đo OD 600 = 0,8 - 1,0
Bƣớc 2: Tạo plug
Pha Seakem Agarose 1,2% trong đệm TE. Cho vào lị vi sóng làm tan đều thạch, sau đó đặt bể cách thủy 65oC đến khi dùng.
Chuyển 200 µl huyền dịch vi khuẩn vào các tube.
Bổ sung 2µl Lysostaphin vào hỗn dịch vi khuẩn trên, vortex.
Trộn mỗi mẫu với 200 µl thạch bằng đầu pipet, nhỏ vào khn tạo plug, để nhiệt độ phịng khoảng 10 phút.
Dùng thìa mỏng gạt mỗi plug vào mỗi ống Falcon 15 ml đã có 3 ml dung dịch Lysozyme (2 mg/ml). Ủ nƣớc 37oC/4 giờ (qua đêm)/lắc.
Loại đệm, sau đó bổ sung 8 ml đệm TE pH 8/30 phút/150 vòng/phút.
Loại đệm TE, cho 1ml Proteinase K /ON/150 vòng/phút.
Loại đệm Proteinase K, rửa bằng 8 ml đệm TE pH 8/ (3lần/2h/150 vòng/phút).
Cắt plug tạo miếng nhỏ, giữ 500µl TE/ 4o
Bƣớc 3: Ủ enzyme cắt giới hạn
1). Phân cắt DNA chủng S. aureus thử nghiệm bằng enzym giới hạn SmaI và chủng chuẩn Salmonella serotype braendrup strain H9812 bằng XbaI. Ủ nhiệt độ
phòng 25oC. Chủng thử nghiệm SmaI = 3 µl x12 = 36 /2 = 18 TR4 = 15 µl x 12 = 180/2 = 90 BSA = 1,5 µl x 12 = 18/2 = 9 H20 = 130,5x12 = 1566/2 = 783 Chủng chuẩn XbaI = 3 µl x3 = 9 TR2 = 15 µl x3 = 45 BSA = 1,5 µl x3 = 4,5 H20 = 130,5 x3 = 391,5 Bƣớc 4: Chạy gel Chuẩn bị 2 lít đệm TBE 0,5%
Chuẩn bị thạch điện di 1% (1,5g Seakem Agarose pha trong 150 ml TBE 0,5%). Làm tan bằng lị vi sóng
Đặt miếng plug đã cắt vào lƣợc, đổ gel. Để gel đông 30 phút
Đặt chƣơng trình chạy điện di phù hợp: Điện áp (voltage density): 6,0V/cm; Góc xung (Included angle): 120o;
Thời gian chuyển đổi ban đầu (Initial Switch Time): 5,0 giây; Thời gian chuyển đổi kết thúc (Final Switch Time): 40,0 giây; Thời gian điện di (Run Time): 17 giờ;
Bƣớc 5: Nhuộm gel trong Ethidium bromide 5% (25µl Etbr/500 ml TBE
0,5%) ngâm 40 phút. Rửa 3 lần H2O/10 phút/lắc nhẹ; Đọc kết quả và phân tích bằng phần mềm Bionumeric version 6.0.
Đánh giá mức độ tƣơng đồng hệ gen của các chủng S. aureus áp dụng các tiêu chí đánh giá của Tenover [154].
2.4.2. Các phƣơng pháp đánh giá định lƣợng nguy cơ S. aureus
Dựa trên phƣơng pháp đánh giá nguy cơ vi sinh vật đã đề cập ở phần 1.3, có thể đƣa ra quy trình đánh giá định lƣợng nguy cơ ngộ độc do S. aureus khi học sinh tiểu học tiêu thụ thực phẩm nhƣ Hình 2.4: