Mơ hình hàm số mũ Mơ hình Beta- Poisson Áp dụng Pinf= 1- e-rμ
Pinf: là xác suất nhiễm trùng
r: hệ số lây nhiễm đặc trƣng cho từng loại vi sinh vật cụ thể
μ: nồng độ trung bình tác nhân gây bệnh (dose)
Pinf= 1-(1+ μ/β)-α khi β≥1 vàα ≤1.
α; β: là hệ số lây nhiễm cố định và đặc trƣng cho mỗi mối nguy vi sinh vật
Ƣu điểm Đơn giản, áp dụng khi các vi sinh vật phân bố ngẫu nhiên và coi xác suất nhiễm trùng cho bất kì vi sinh vật nào là r.
Khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của mơ hình hàm số mũ, khi
r giả định là khác nhau theo
một phân bố beta. Nhƣợc
điểm
Các tác động thực tế khơng hồn tồn thỏa mãn vì giữa sự biến đổi nhiễm trùng trong các mầm bệnh và sự thay đổi giữa các vật chủ trong tính nhạy cảm bị bỏ qua
Phức tạp hơn
1 3 7 Các phƣơng pháp dùng trong đánh giá phơi nhiễm S. aureus
Đánh giá phơi nhiễm bao gồm đánh giá về mức độ phơi nhiễm ƣớc tính hoặc đánh giá thực tế ở ngƣời. Đối với tác nhân vi sinh, đánh giá phơi nhiễm có thể dựa vào khả năng nhiễm bẩn thực phẩm từ một tác nhân cụ thể hoặc độc tố của nó và dựa trên thơng tin dinh dƣỡng. Đánh giá phơi nhiễm cần xác định rõ lƣợng thực phẩm quan tâm.
Các yếu tố phải đƣợc xem xét đối với đánh giá phơi nhiễm bao gồm tần suất nhiễm bẩn thực phẩm do tác nhân gây bệnh gây ra và mức độ có mặt của tác nhân có trong các loại thực phẩm này theo thời gian. Yếu tố khác cần đƣợc xem xét trong đánh giá là các mơ hình tiêu thụ, vai trị của ngƣời chế biến thực phẩm (nguồn gây nhiễm), sự tiếp xúc bằng tay với sản phẩm và các tác động của thời gian/ nhiệt độ môi trƣờng [8].
1.3.7.1. Phương pháp định lượng S. aureus trong các đối tượng mẫu thu thập trong chuỗi cung ứng thực phẩm
Để đánh giá định lƣợng nguy cơ vi sinh vật thì việc định lƣợng mật độ vi sinh vật trong thực phẩm đóng vai trị quan trọng, giúp tính đƣợc liều nhiễm bệnh trong các bƣớc mô tả nguy cơ.
Với S. aureus, việc định lƣợng trong thực phẩm có nhiều phƣơng pháp khác nhau dựa trên các môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc. TCVN 4830-1:2005 là phƣơng pháp tiêu chuẩn quốc gia đƣợc biên soạn dựa trên tiêu chuẩn quốc tế ISO 6888- 1:1999 đã đƣợc thẩm định trên các nền mẫu thực phẩm và cho độ tin cậy cao khi áp dụng để định lƣợng S. aureus [3]. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng để định lƣợng tụ cầu có phản ứng dƣơng tính với coagulase trên đĩa thạch có mặt trong thực phẩm bằng cách đếm số khuẩn lạc thu đƣợc trên môi trƣờng đặc (môi trƣờng Bair-Parker) sau khi ủ trong điều kiện hiếu khí ở 35oC hoặc 37 o
C.
1.3.7.2. Phương pháp nhận dạng bằng sinh học phân tử: phương pháp PCR phân tích gen coagulase và gen sinh độc tố
Với ƣu điểm là nhanh và độ nhạy cao, phƣơng pháp PCR đƣợc sử dụng phổ biến để phát hiện nhiều mối nguy vi sinh vật trong thực phẩm. Đối với mối nguy S.
aureus, phƣơng pháp PCR giúp xác định nhanh và nhạy các chủng S. aureus chứa
gen sinh độc tố nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm [70] và gen coa đặc trƣng của
S. aureus [160]. Nhiều tác giả trên thế giới đã sử dụng phƣơng pháp này để phát
hiện hơn 20 loại gen sinh độc tố ruột (Staphylococcal enterotoxin), gen giống độc tố ruột và gen coa trên các loại thực phẩm khác nhau góp phần tìm ngun nhân gây
Jinghua Cheng [76]...Bằng việc sử dụng phƣơng pháp PCR, Jamaira Fereira Veras và cộng sự đã phát hiện đƣợc gen coa của 07 chủng tụ cầu trong khi phƣơng pháp
thử nghiệm sinh hóa truyền thống khơng phát hiện đƣợc [160].
1.3.7.3. Phương pháp PFGE phân tích sự nhiễm chéo và truy suất nguồn gốc lây nhiễm S. aureus trong thực phẩm
Kỹ thuật điện di trƣờng xung PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) là phƣơng pháp điện di trong trƣờng điện thay đổi. PFGE là tiêu chuẩn vàng trong phân loại học phân tử và có ứng dụng quan trọng trong các chƣơng trình giám sát và kiểm sốt dịch bệnh nhƣ các bệnh nhiễm trùng bệnh viện, xâm lấn, hô hấp cũng nhƣ truy xuất nguồn gốc sự ô nhiễm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật [103]. PFGE đƣợc mô tả lần đầu tiên năm 1984 để phân tách các đoạn DNA kích thƣớc lớn bằng enzym endonucleases. Ban đầu PFGE đƣợc sử dụng để so sánh các chủng thu đƣợc trong suốt các cuộc giám sát dịch bệnh để đánh giá sự liên quan giữa các vụ dịch bệnh để đƣa ra cảnh báo cho cộng đồng. Năm 1996, Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh của Mỹ (CDC) đã sử dụng PFGE phân loại phân tử ở cấp độ quốc gia để giám sát ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật [103].
Ƣu điểm của phƣơng pháp: Trong khi các phƣơng pháp phân loại dƣới loài khác đỏi hỏi sự phát triển đặc hiệu nhân tố đích thì quy trình làm PFGE cơ bản giống nhau và có thể sử dụng đƣợc cho hầu hết các sinh vật có thể ni cấy. Phƣơng pháp này đã đƣợc chuẩn hóa, có độ tái lặp, độ ổn định và phù hợp với nghiên cứu dịch tễ học nói chung [103].
Cho đến nay, phƣơng pháp PFGE đƣợc coi nhƣ là một tiêu chuẩn vàng để so sánh khi phân tích "vân tay" (fingerprinting) genome của các vi khuẩn gây bệnh. Nó cho khả năng phân biệt tƣơng đƣơng hoặc mạnh hơn so với các phƣơng pháp định týp khác. Hơn nữa, PFGE cũng cho kết quả nhìn thấy bằng mắt thƣờng, khơng cần sử dụng đến Southern blot và không cần các đầu dò DNA, RNA. Khác với ribotyping, PFGE có thể kiểm tra tồn bộ gen khi cần thiết, vì thế mức phân biệt đặc hiệu chủng sẽ lớn hơn. PFGE là phƣơng pháp hữu hiệu hơn RFLP trong việc phân tích mối quan hệ ở mức độ lồi và dƣới loài [121].
Hạn chế khi sử dụng PFGE: Cần nhiều thời gian để phân tích (5-6 ngày) và chi phí phân tích đắt do giá của hóa chất sử dụng cao. Hơn nữa, việc thực hiện phƣơng pháp này đòi hỏi nhân viên đƣợc đào tạo đặc biệt và thiết bị tinh vi [121].
Trên thế giới phƣơng pháp PFGE đã đƣợc áp dụng rộng rãi trong phân tích S.
aureus và tỏ ra là một cơng cụ hữu ích và vƣợt trội so với các phƣơng pháp khác,
đặc biệt trong việc giúp diễn giải mối quan hệ về loài giữa các chủng S. aureus
[144]. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu sử dụng PFGE để điều tra dịch tễ học phân tử [27, 38, 46] nhƣng hiện chƣa có tác giả nào sử dụng phƣơng pháp PFGE để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các chủng S. aureus phân lập đƣợc ở thực
phẩm cũng nhƣ trên các đối tƣợng trong bếp ăn tập thể các trƣờng học.
1.3.7.4. Phương pháp điều tra khẩu phần
Đánh giá phơi nhiễm là việc đánh giá lƣợng mầm bệnh ăn vào theo thực phẩm sau khi đã tìm đƣợc liều - đáp ứng (gây bệnh) [31].
Để xác định đƣợc lƣợng thực phẩm tiêu thụ, phƣơng pháp điều tra khẩu phần cần đƣợc tiến hành. Hiện nay có nhiều phƣơng pháp điều tra khẩu phần nhƣ phƣơng pháp ghi sổ và kiểm kê, phƣơng pháp cân đong, phƣơng pháp ghi chép, phƣơng pháp hỏi ghi 24 giờ qua, phƣơng pháp điều tra tần suất thực phẩm, phƣơng pháp hỏi tiền sử dinh dƣỡng…[32]
Việc lựa chọn phƣơng pháp điều tra khẩu phần phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu. Đối với điều tra khẩu phần từng cá thể riêng rẽ thì phƣơng pháp ghi chép (nhật ký), phƣơng pháp hỏi ghi 24 giờ qua thƣờng đƣợc áp dụng. Đối với điều tra khẩu phần ở bếp ăn tập thể thì phƣơng pháp ghi sổ và kiểm kê, phƣơng pháp cân đong thƣờng đƣợc áp dụng [32]. Trong nghiên cứ của chúng tơi, với mục đích xác định đƣợc lƣợng thực phẩm học sinh ăn tại trƣờng, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp kiểm tra hồ sơ xuất nhập thực phẩm kết hợp phƣơng pháp cân đong thực phẩm tại bếp ăn ở các giai đoạn trƣớc và sau khi làm sạch, nấu chín, sau khi ăn cịn lại [32].
1.3.7.5. Phương pháp mô phỏng Monte Carlo
Mơ phỏng Monte Carlo là một phân tích mở rộng các trƣờng hợp có thể xảy ra. Nó là một mơ hình tốn học đƣợc xây dựng để mô tả con đƣờng đánh giá phơi nhiễm, bao gồm tất cả các biến có thể ảnh hƣởng đến sự phơi nhiễm. Thơng thƣờng,
nó sẽ có dạng một loạt các phƣơng trình tốn học đƣợc kết hợp. Kết quả của sự kết hợp này là sự biểu hiện phơi nhiễm của ngƣời tiêu thụ. Mơ hình đƣợc viết thành phần mềm mô phỏng Monte Carlo, cho phép ngƣời đánh giá dễ dàng xác định phân phối xác suất, thay vì các giá trị rời rạc cho mỗi biến.
Phần mềm đánh giá mơ hình bằng cách chọn ngẫu nhiên một giá trị cho mỗi biến từ phân phối đặc trƣng. Xác suất của bất kỳ giá trị nào đƣợc chọn đều phù hợp với phân phối xác suất tƣơng ứng. Sử dụng các giá trị đã chọn, các giá trị đƣợc kết hợp theo các phƣơng trình tốn học bao gồm mơ hình đánh giá phơi nhiễm và sự phơi nhiễm đƣợc tính tốn. Q trình lựa chọn và tính tốn này đƣợc gọi là sự lặp lại của mơ hình và thể hiện sự phơi nhiễm từ một sự kết hợp có thể có của các trƣờng hợp. Có rất nhiều trƣờng hợp nhƣ vậy, tuy nhiên, có nhiều hoặc ít khả năng hơn những trƣờng hợp khác và dẫn đến sự phơi nhiễm nhiều hoặc ít hơn. Để ƣớc tính tồn bộ phạm vi phơi nhiễm có thể có và khả năng xảy ra, phần mềm mơ phỏng lặp lại các phép tính nhiều lần (hàng chục nghìn hoặc thậm chí hàng triệu lần). Kết quả của mỗi lần lặp đƣợc ghi lại và một biểu đồ về phạm vi phơi nhiễm và xác suất xảy ra tạo ra đánh giá phơi nhiễm [163].
1 3 8 Phƣơng pháp dùng trong mô tả nguy cơ
Đây là bƣớc cuối cùng của quy trình đánh giá nguy cơ. Mục đích của mơ tả nguy cơ là tổng hợp các thông tin từ đánh giá phơi nhiễm và đánh giá liều-đáp ứng để từ đó đánh giá các ảnh hƣởng có hại của nguy cơ. Các mơ hình liều-đáp ứng liên quan đến việc ƣớc tính xác suất nhiễm vi sinh vật. Đầu ra của mô tả nguy cơ vi sinh thƣờng là nguy cơ bị nhiễm loại vi sinh vật đang đƣợc quan tâm trong một quần thể nào đó. Trong một số trƣờng hợp khác, đầu ra của mơ tả nguy cơ có thể là nguy cơ mắc bệnh thay vì nguy cơ nhiễm vi sinh nếu liều-đáp ứng cho bệnh đã có sẵn.
Bƣớc mơ tả nguy cơ cần cung cấp cho những nhà quản lý nguy cơ những cơ sở khoa học để có thể ra quyết định về các giải pháp đối với nguy cơ đƣợc định lƣợng và các thơng tin cần thiết để có thể truyền thơng nguy cơ một cách trung thực, chính xác và hiệu quả [31].
Có hai phƣơng pháp tính tốn nguy cơ vi sinh là dùng giá trị trung bình (deterministic approach hay cịn gọi là point estimate) và phƣơng pháp tính xác suất bằng mơ phỏng Monte Carlo (probabilistic approach hay còn gọi là stochastic approach)[31]. Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu nhƣợc điểm khác nhau, chi tiết thể hiện trong Bảng 1.4.
Bảng 1.4: So sánh hai phƣơng pháp mơ tả nguy cơ trung bình và mơ phỏng Monte Carlo
Nội dung Phƣơng pháp tính trung b nh Phƣơng pháp tính xác suất bằng mô phỏng Monte Carlo
Nguyên lý của phƣơng pháp
Ở mỗi bƣớc của đánh giá nguy cơ, một giá trị ƣớc lƣợng duy nhất đƣợc đƣa vào để đánh giá nguy cơ
Dùng những số liệu khoa học dƣới dạng những hàm phân bố để tính tốn ra nguy cơ cuối cùng và đƣợc thể hiện bằng hàm phân bố nguy cơ.
Ƣu điểm
Đơn giản và dễ hiểu cho ngƣời đọc kết quả và dùng kết quả này, đặc biệt dễ hiểu cho các nhà quản lý nguy cơ
- Kết quả có thể dùng để tạo ra các kịch bản của nguy cơ phục vụ cho việc quản lý nguy cơ với nhiều thông tin hơn là kết quả từ giá trị trung bình. - Giúp các nhà quản lý nguy cơ biết đƣợc khả năng xảy ra của các mức nguy cơ nhƣ thế nào và sẽ phục vụ tốt hơn cho việc quản lý nguy cơ. Nhƣợc
điểm
Khơng nói lên đƣợc tính biến thiên của nguy cơ vì bản chất của đánh giá nguy cơ đƣa ra những kết quả không chắc chắn.
Tƣơng đối phức tạp và cần có những hiểu biết sâu khơng những về mặt tốn học mà cịn là những hiểu biết về cơ chế sinh học để có thể chọn những mơ hình hợp lý với quy luật sinh học của các mối nguy vi sinh
Ứng dụng Thƣờng đƣợc sử dụng trong đánh giá nguy cơ hóa học
Thƣờng đƣợc sử dụng trong đánh giá nguy cơ vi sinh vì tất cả các quá trình biến đổi của vi sinh vật trong thực phẩm nhƣ chết đi, sinh trƣởng, phát triển đều có thể mơ hình hóa
Cách hợp lý nhất để mô tả nguy cơ nhiễm bệnh do S. aureus của học sinh là
phƣơng pháp xác suất với mơ phỏng Monte Carlo vì kết quả có thể dùng để tạo ra các kịch bản của nguy cơ phục vụ cho việc quản lý nguy cơ với nhiều thông tin hơn là kết quả từ giá trị trung bình
1 3 9 Đánh giá sự không chắc chắn
Trong tồn bộ quy trình đánh giá nguy cơ, ở tất cả các bƣớc đều có thể có sự không chắc chắn trong các kết quả. Theo Cơ quan bảo vệ môi trƣờng Mỹ (EPA, 1992), sự không chắc chắn do 3 nguyên nhân chính. Thứ nhất là sự không chắc chắn do việc mất mát hoặc thiếu hụt thơng tin (ví dụ sai số mơ tả, sai số do thu thập, sai số do phiên giải và do phân tích khơng đầy đủ). Thứ hai là sự khơng chắc chắn do phƣơng pháp đo lƣờng: sai số khi đo, sai số chọn mẫu, sự biến thiên, sử dụng số liệu chọn mẫu. Thứ ba là sự không chắc chắn trong các lý thuyết khoa học khi xây dựng các mơ hình dự đốn và tính tốn.
Tùy vào từng mơ hình đánh giá, nghiên cứu khác nhau mà ngƣời làm đánh giá có các phƣơng pháp khác nhau để giảm sự không chắc chắn cũng nhƣ ngƣời ra quyết định có các quyết định khác nhau liên quan đến sự không chắc chắn trong đánh giá nguy cơ. Để có thể phân tích sự không chắc chắn, tùy loại nguy cơ khác nhau mà ngƣời đánh giá có thể áp dụng phƣơng pháp phân tích hoặc phƣơng pháp Monte Carlo để xác định các biến đo lƣờng không chắc chắn [31].
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2 1 1 Đối tƣợng nghiên cứu
- Ngƣời chế biến thực phẩm.
- Một số nhóm thực phẩm phổ biến: thực phẩm từ sữa, trứng, thịt… - Dụng cụ chứa đựng, chế biến thực phẩm.
- S. aureus phân lập từ các nhóm mẫu (thực phẩm, mẫu lau tăm bông từ bàn
tay của ngƣời chế biến thực phẩm, mẫu lau bằng gạc từ dụng cụ chứa đựng, chế biến thực phẩm) trong BĂTT tại một số trƣờng tiểu học bán trú ở Hà Nội.
2 1 2 Thời gian nghiên cứu
Thời gian thu thập mẫu và phân tích: từ tháng 04/2015 đến tháng 12/2016
2 1 3 Địa điểm nghiên cứu
- Viện Kiểm nghiệm ATVSTPQG
- Một số trƣờng tiểu học bán trú thuộc 12 Quận nội thành Hà Nội: gồm Hà Đông, Thanh Xn, Hồn Kiếm, Ba Đình, Hai Bà Trƣng, Hoàng Mai, Đống Đa, Tây Hồ, Cầu Giấy, Nam Từ Liêm, Bắc Từ Liêm, Long Biên
2.2. HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ
2.2.1. Hóa chất, mơi trƣờng, chủng chuẩn
Bảng 2.1: Danh mục hóa chất, mơi trƣờng, chủng chuẩn
Mục đích Hóa chất, Mơi trƣờng chính Hãng sản xuất
Phân lập chủng
S. aureus
Bair Parker agar Merck
BHI broth Merck
Bactident coagulase test Merck
Phân tích gen sinh độc tố
KIT PepMan Ultra ABI
Proteinase K Sigma
Agarose Sigma
Redsafe Phân tích độc tố
ruột của tụ cầu
Bộ KIT TECRA Staphyloccoccal Enterotoxins VIA
Merck
Phân tích sự đa dạng di truyền
Seakem gold Agarose Lonza
Lysostaphin Sigma
Lysozyme Sigma
Proteinase K Sigma
Enzyme SmaI Sigma
Enzyme XbaI Sigma