Chƣơng 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1.3. Lấy mẫu thực phẩm
Thực phẩm thuộc các nhóm khác nhau đƣợc thu thập theo các tiêu chuẩn hiện hành [52] cụ thể nhƣ sau:
+ Lƣợng mẫu tối thiểu cần lấy là 100 - 150g (thức ăn đặc) hoặc 100 - 150ml (thức ăn lỏng). Trộn đều thực phẩm trƣớc khi lấy mẫu để đảm bảo tính đồng nhất. Nếu thức ăn hay ngun liệu thừa ít hơn lƣợng quy định này thì lấy tồn bộ lƣợng còn lại. Nếu thức ăn hay ngun liệu thừa ít hơn 10g/ml thì khơng lấy.
+ Mỗi loại thức ăn đƣợc lấy và đựng trong hộp/túi riêng vô trùng. + Ghi rõ tên thực phẩm bằng bút viết kính hoặc nhãn khơng thấm nƣớc.
2.4.1.4. Phương pháp lấy mẫu dụng cụ chế biến, chứa đựng thực phẩm, mẫu vệ sinh bàn tay.
Việc lấy mẫu vệ sinh bàn tay và vệ sinh dụng cụ đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của TCVN 8129:2009:
+ Lấy một cái tăm bông/miếng gạc từ túi đựng vô trùng và làm ẩm đầu tăm bông bằng cách nhúng vào ống nghiệm đựng dung dịch pha lỗng vơ trùng. Ấn đầu tăm bông/miếng gạc vào thành ống để loại bỏ nƣớc thừa. Đặt tăm bông/miếng gạc lên bề mặt dụng cụ và quét một vùng khoảng 20 cm2
- 100 cm2, xoay trịn tăm bơng giữa ngón cái và ngón trỏ theo hai hƣớng vng góc với nhau [7]. Mẫu vệ sinh bàn tay thì qt từ lịng bàn tay, mu bàn tay, các kẽ ngón tay. Lấy đủ 2 bàn tay/nhân viên chế biến thực phẩm.
+ Đặt tăm bông vào trong ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng và bẻ que bỏ đi một cách vô trùng [7].
+ Vận chuyển: Vận chuyển các mẫu thu đƣợc từ phƣơng pháp này trong vòng tốt nhất là 4 giờ trong hộp giữ lạnh ở 1oC - 4oC. Kiểm tra trong phịng thí nghiệm càng sớm càng tốt và trong vịng khơng q 24 giờ [7].
2.4.1.5. Phương pháp định lượng S. aureus trong thực phẩm
Việc định lƣợng S. aureus trong thực phẩm đƣợc thực hiện theo TCVN
4830-1:2005 bao gồm 04 bƣớc chính (Hình 2.2). Mẫu thu thập sau khi đƣợc đồng nhất, pha loãng tiến hành cấy lên bề mặt của môi trƣờng đặc chọn lọc (Bair-Parker), sử dụng hai (hoặc ba) đĩa, dùng một lƣợng mẫu thử quy định nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc với một lƣợng huyền phù ban đầu quy định nếu sản phẩm ở dạng khác. Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu, dùng hai (ba) đĩa cho mỗi độ pha loãng. Ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 35C hoặc 37C và kiểm tra sau 24 giờ và 48 giờ.Tính số lƣợng
S. aureus có phản ứng dƣơng tính với coagulase trong một mililit, hoặc trong một
gam mẫu từ số lƣợng khuẩn lạc điển hình và/hoặc khơng điển hình trên các đĩa ở các nồng độ pha loãng đã chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và đƣợc khẳng định bằng kết quả thử coagulase dƣơng tính.
2.4.1.6. Phương pháp phân tích gen sinh độc tố dựa trên kĩ thuật PCR
Nghiên cứu sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện các gen sinh độc tố
sea, seb, sec, sed và gen coa, femA giúp khẳng định nhanh mối nguy S. aureus sinh
độc tố trong thực phẩm và từ các mẫu swab của ngƣời chế biến, dụng cụ tiếp xúc với thực phẩm. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu đƣợc thể hiện trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Trình tự mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR Gen Trình tự primer (5’-3’) Gen Trình tự primer (5’-3’) Kích thƣớc sản phẩm (bp) Ghi chú Tài liệu tham khảo
sea GCA GGG AAC AGC TTT AGG C 520 Mã hóa độc tố A
[160]
GTT CTG TAG AAG TAT GAA ACA CG
seb GTA TGG TGG TGT AAC TGA GC 163 Mã hóa độc tố B
CCA AAT AGT GAC GAG TTA GG
sec CTT GTA TGT ATG GAG GAA TAA CAA
283 Mã hóa độc tố C
TGC AGG CAT CAT ATC ATA CCA
sed GTG GTG AAA TAG ATA GGA CTG C 384 Mã hóa độc tố D
ATA TGA AGG TGC TCT GTG G
femA AAA AAA GCA CAT AAC AAG CG 131 Gen đặc
trƣng của
S. aureus
GAT AAA GAA GAA ACC AGC AG
coa GAT AAA GAA GAA ACC AGC AG 987 Gen đặc trƣng của
S. aureus
TGC TTT CGA TTG TTC GAT GC
Quy trình luân nhiệt của các gen femA và các gen độc tố enterotoxin
1 chu kì: 95ºC/ 10 phút
30 chu kì: 95ºC/ 30 giây, 60ºC/ 45 giây, 72ºC/ 60 giây 72ºC/ 10 phút
Quy trình luân nhiệt của các gen coa
1 chu kì: 94ºC/ 2 phút
30 chu kì: 95ºC/ 30 giây, 55ºC / 2 phút, 72ºC/ 4 phút 72ºC / 7 phút
Sau khi kết thúc 30 chu kỳ, mẫu đƣợc giữ ở nhiệt độ 4oC cho tới lúc điện di.
2.4.1.7. Phương pháp phân tích độc tố ruột SE
Bộ KIT TECRA Staphyloccoccal Enterotoxins VIA đƣợc sử dụng cho mục đích này. Việc phân tích đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Bộ KIT phát hiện các độc tố SEA, SEB, SEC, SED và SEE.
2.4.1.8. Phương pháp điện di trường xung (PFGE)
Nguyên lý: bộ gen của vi khuẩn S. aureus đƣợc xử lý bằng enzym cắt giới
hạn SmaI và điện di các đoạn DNA đã xử lý bằng bộ điện di trƣờng xung điện để
nhận đƣợc kiểu mẫu PFGE. Sự thay đổi có tính chu kì hƣớng của điện trƣờng cho phép phân tách và xác định kích thƣớc của các đoạn giới hạn và tạo ra một dấu vân tay DNA (DNA fingerprint), điều này giúp đánh giá mối quan hệ của các chủng vi khuẩn phân tích [103].
Hình 2.3: Quy trình phân tích PFGE [72] Quy trình chi tiết nhƣ sau [72, 103]: Quy trình chi tiết nhƣ sau [72, 103]:
Bƣớc 1: Cấy vi khuẩn
Chủng S. aureus cấy trên đĩa thạch Nutrient agar/thạch máu cừu 5%, sau đó lấy 1 khuẩn lạc cấy chuyển tiếp tạo khuẩn lạc thuần (lấy khuẩn lạc tƣơi <18 giờ)
Hòa tan trong TE đo OD 600 = 0,8 - 1,0
Bƣớc 2: Tạo plug
Pha Seakem Agarose 1,2% trong đệm TE. Cho vào lò vi sóng làm tan đều thạch, sau đó đặt bể cách thủy 65oC đến khi dùng.
Chuyển 200 µl huyền dịch vi khuẩn vào các tube.
Bổ sung 2µl Lysostaphin vào hỗn dịch vi khuẩn trên, vortex.
Trộn mỗi mẫu với 200 µl thạch bằng đầu pipet, nhỏ vào khn tạo plug, để nhiệt độ phịng khoảng 10 phút.
Dùng thìa mỏng gạt mỗi plug vào mỗi ống Falcon 15 ml đã có 3 ml dung dịch Lysozyme (2 mg/ml). Ủ nƣớc 37oC/4 giờ (qua đêm)/lắc.
Loại đệm, sau đó bổ sung 8 ml đệm TE pH 8/30 phút/150 vòng/phút.
Loại đệm TE, cho 1ml Proteinase K /ON/150 vòng/phút.
Loại đệm Proteinase K, rửa bằng 8 ml đệm TE pH 8/ (3lần/2h/150 vòng/phút).
Cắt plug tạo miếng nhỏ, giữ 500µl TE/ 4o
Bƣớc 3: Ủ enzyme cắt giới hạn
1). Phân cắt DNA chủng S. aureus thử nghiệm bằng enzym giới hạn SmaI và chủng chuẩn Salmonella serotype braendrup strain H9812 bằng XbaI. Ủ nhiệt độ
phòng 25oC. Chủng thử nghiệm SmaI = 3 µl x12 = 36 /2 = 18 TR4 = 15 µl x 12 = 180/2 = 90 BSA = 1,5 µl x 12 = 18/2 = 9 H20 = 130,5x12 = 1566/2 = 783 Chủng chuẩn XbaI = 3 µl x3 = 9 TR2 = 15 µl x3 = 45 BSA = 1,5 µl x3 = 4,5 H20 = 130,5 x3 = 391,5 Bƣớc 4: Chạy gel Chuẩn bị 2 lít đệm TBE 0,5%
Chuẩn bị thạch điện di 1% (1,5g Seakem Agarose pha trong 150 ml TBE 0,5%). Làm tan bằng lị vi sóng
Đặt miếng plug đã cắt vào lƣợc, đổ gel. Để gel đông 30 phút
Đặt chƣơng trình chạy điện di phù hợp: Điện áp (voltage density): 6,0V/cm; Góc xung (Included angle): 120o;
Thời gian chuyển đổi ban đầu (Initial Switch Time): 5,0 giây; Thời gian chuyển đổi kết thúc (Final Switch Time): 40,0 giây; Thời gian điện di (Run Time): 17 giờ;
Bƣớc 5: Nhuộm gel trong Ethidium bromide 5% (25µl Etbr/500 ml TBE
0,5%) ngâm 40 phút. Rửa 3 lần H2O/10 phút/lắc nhẹ; Đọc kết quả và phân tích bằng phần mềm Bionumeric version 6.0.
Đánh giá mức độ tƣơng đồng hệ gen của các chủng S. aureus áp dụng các tiêu chí đánh giá của Tenover [154].
2.4.2. Các phƣơng pháp đánh giá định lƣợng nguy cơ S. aureus
Dựa trên phƣơng pháp đánh giá nguy cơ vi sinh vật đã đề cập ở phần 1.3, có thể đƣa ra quy trình đánh giá định lƣợng nguy cơ ngộ độc do S. aureus khi học sinh tiểu học tiêu thụ thực phẩm nhƣ Hình 2.4:
Hình 2.4: Quy trình đánh giá định lƣợng nguy cơ S. aureus trong thực phẩm [31, 79, 129] [31, 79, 129]
2.4.2.1. Nhận dạng mối nguy
Nguyên lý: Dựa trên những hiểu biết có sẵn, đánh giá mức độ ảnh hƣởng của
S. aureus đến sức khỏe con ngƣời khi tiêu thụ thực phẩm và qua đó đƣa ra nhận
định về S. aureus với tƣ cách là một mối nguy.
Nội dung áp dụng: Bằng phƣơng pháp nghiên cứu tài liệu, các cơng trình nghiên cứu trƣớc đây để mơ tả tổng quan về các nội dung sau:
+ Tình hình an tồn thực phẩm tại các bếp ăn tập thể trƣờng học. + Ngộ độc thực phẩm do S. aureus, nguyên nhân, triệu chứng.
+ Đặc điểm của S. aureus và con đƣờng truyền nhiễm vào thực phẩm gây bệnh cho con ngƣời
+ Ảnh hƣởng của ngộ độc thực phẩm do S. aureus đến sức khỏe, gánh nặng kinh tế. Việc nhận dạng mối nguy bao gồm các bƣớc chính nhƣ thiết lập bối cảnh, xác định mối nguy, đánh giá mối nguy. Chi tiết đƣợc trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3: Các bƣớc chính nhận dạng mối nguy [31]:
Thiết lập bối cảnh
Đặc điểm sản xuất, chế biến, phân phối; quy mô dân số, nhân khẩu học, chăn nuôi, giết mổ, xử lý chế biến, phân phối, đặc điểm địa lý, vệ sinh mơi trƣờng, tình hình sức khỏe của dân cƣ, dịch vụ chăm sóc sức khỏe
Xác định mối nguy
- Mơ tả đặc tính vật lý, mức độ, xác suất, tần số và các yếu tố gây bệnh, địa điểm vùng bị ảnh hƣởng
- Đặc tính của tác nhân gây bệnh truyền qua thực phẩm (sự tồn tại, khả năng chống chịu với điều trị…)
- Mô tả con đƣờng lây truyền qua thực phẩm, nguyên nhân gây ra các vụ dịch, các con đƣờng lây nhiễm có ý nghĩa ra sao
- Mô tả đặc điểm bệnh do lây truyền qua thực phẩm (loại bệnh, thời gian ủ bệnh, diễn biến bệnh…)
- Mô tả các rủi ro đến sức khỏe chính mà mối nguy gây ra trong cả hai tình huống bình thƣờng và nguy cơ: vd: thực phẩm chế biến sẵn hệ thống bảo quản không tốt
Đánh giá mối nguy
- Đánh giá xác suất: dựa vào lịch sử trƣớc đó để đánh giá khả năng xảy ra sự kiện trong khoảng thời gian nhất định, tần suất xảy ra nhƣ thế nào, thời gian xảy ra bao lâu
- Đánh giá hậu quả: tác động nguy hiểm đến cuộc sống, cơ sở hạ tầng, nền kinh tế
2.4.2.2. Mô tả mối nguy
Trong nghiên cứu này chúng tơi áp dụng mơ hình hàm số mũ, nhƣ mơ tả dƣới đây của Hass và cộng sự (1999):
Trong đó, P là xác suất bị bệnh, d là số lƣợng S. aureus ăn phải (cfu/ khẩu phần ăn), r là xác suất các tế bào đơn S. aureus gây bệnh. Nhiều y văn kinh điển và
các nghiên cứu cùng chủ đề sử dụng hệ số r =7,64 x10-8 [94, 114, 152].
2.4.2.3. Đánh giá phơi nhiễm S. aureus trong thực phẩm
Phƣơng pháp đánh giá phơi nhiễm S. aureus trong thực phẩm giúp xác định
đƣợc con đƣờng phơi nhiễm, tần suất và lƣợng S. aureus đƣợc hấp thu vào cơ thể
trong quần thể [142]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng áp dụng phƣơng pháp đó với chi tiết các bƣớc thực hiện đƣợc trình bày ở Bảng 2.4.
Bảng 2.4: Phƣơng pháp đánh giá phơi nhiễm
Các bƣớc Phƣơng pháp
Bƣớc 1: Xác định con đƣờng phơi nhiễm mối nguy
- Dựa vào sự nghiên cứu các tài liệu, ý kiến của chuyên gia…
Bƣớc 2: Định lƣợng nồng độ mối nguy vi sinh vật trong thực phẩm
- Dùng các phƣơng pháp phân tích khác nhau để định lƣợng vi sinh vật trên một đơn vị thực phẩm tiêu thụ (phân tích trực tiếp ở sản phẩm sẵn sàng cho tiêu thụ hoặc dùng phƣơng pháp ngoại suy). Bƣớc 3: Lƣợng giá mức tiêu
thụ và các đƣờng phơi nhiễm
- Tính số liệu về tỉ lệ phơi nhiễm và tần suất phơi nhiễm (dựa vào số liệu điều tra khẩu phần ăn) để biết đƣợc số lƣợng vi sinh vật đƣợc đƣa vào cơ thể (d)
Trong trƣờng hợp đánh giá phơi nhiễm S. aureus từ thực phẩm thì con đƣờng chủ yếu là do ăn uống
Hình 2.5: Sơ đồ mơ tả quá trình phơi nhiễm với S. aureus trong thực phẩm từ trang trại đến bàn ăn (farm-to-fork) [163].
Chú thích: S. aureus có thể bị nhiễm từ động vật lấy thịt bị bệnh. Lây nhiễm chéo có thể xảy ra trong q trình giết mổ nếu khơng đảm bảo vệ sinh. Trong q trình phân phối, nếu khơng đảm bảo điều kiện bảo quản về nhiệt độ và thời gian, vi khuẩn này cũng sẽ phát triển và sinh độc tố. Các nguyên nhân trên dẫn đến nguy cơ ngộ độc thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng nếu không tuân thủ các quy định về an toàn thực phẩm.
Trong BĂTT, con đƣờng lây nhiễm S. aureus vào thực phẩm và sinh độc tố đƣợc nhận dạng theo Hình 2.6 [106]. Quá trình phơi nhiễm S. aureus gồm 5 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Nguyên liệu chế biến: Vi khuẩn S. aureus có thể bị nhiễm trƣớc hoặc sau khi thực phẩm đƣợc nhập vào bếp ăn của trƣờng.
Giai đoạn 2: Bảo quản/chế biến (sơ chế) trƣớc khi nấu: Trong giai đoạn này, thực phấm sống đƣợc chế biến, trộn các nguyên liệu, tẩm ƣớp gia vị không phù hợp thì vi khuẩn S. aureus có thể bị nhiễm tiếp tục và phát triển. Khi lƣợng vi khuẩn này tăng lên lớn hơn 5log CFU/g thực phẩm thì độc tố ruột đƣợc sinh ra [86].
Giai đoạn 3: Giai đoạn nấu: Nếu ngƣời chế biến thực phẩm tuân thủ theo đúng hƣớng dẫn đảm bảo ATTP thì tế bào vi khuẩn S. aureus sẽ bị tiêu diệt và
ngƣợc lại lƣợng vi khuẩn S. aureus chỉ bị chết hoặc bất hoạt một phần. Trong cả 2 trƣờng hợp này thì lƣợng độc tố ruột nếu sinh ra trƣớc khi nấu sẽ không bị phá hủy do khả năng bền nhiệt và chịu đƣợc pH thấp của độc tố [60, 122].
Giai đoạn 4: Giai đoạn sau khi nấu: Vi khuẩn S. aureus có trong thực phẩm ở
giai đoạn này có thể do ngƣời chế biến khơng tn thủ thực hành sản xuất tốt (nhƣ nhiệt độ và thời gian nấu chƣa đủ để giết toàn bộ vi khuẩn S. aureus) hay không
tuân thủ vệ sinh tốt làm lây nhiễm chéo từ môi trƣờng, dụng cụ chế biến (dao thái thực phẩm sống và thực phẩm chín), dụng cụ chứa đựng… hay từ ngƣời chế biến thực phẩm không đeo bảo hộ lao động.
Giai đoạn 5: Giai đoạn lƣu trữ/bảo quản trƣớc khi học sinh ăn: Nếu điều kiện bảo quản không thủ về nhiệt độ và thời gian thì S. aureus bị nhiễm vào thực phẩm ở giai đoạn 4 sẽ tiếp tục phát triển, sinh độc tố.
Để đánh giá sự phơi nhiễm S. aureus của học sinh do ăn thịt lợn và trứng, từ
các quy trình chuẩn, chúng tơi đã thực hiện nhƣ sau:
+ Điều tra tiêu thụ thực phẩm của học sinh tiểu học trong địa bàn nghiên cứu nhằm xác định tần suất ăn (n) và lƣợng ăn (m) của học sinh đối với các thực phẩm đích là thịt lợn và trứng.
+ Thu thập mẫu và phân tích sự nhiễm S. aureus trong thực phẩm nghiên cứu. + Tính liều nhiễm (d) S. aureus bằng tích số của lƣợng thức ăn đã ăn và nồng độ nhiễm của S. aureus trong thức ăn, nhƣ công thức dƣới đây:
m C
d s
Các biến số đánh giá phơi nhiễm đƣợc xác định theo các phƣơng pháp đƣợc mô tả ở Bảng 2.5.
Bảng 2.5: Mô tả biến số đánh giá phơi nhiễm
TT Biến số Định nghĩa biến Chỉ số
Phƣơng pháp thu thập
1
Mật độ S. aureus
trong mẫu thức ăn nấu từ thịt lợn hoặc trứng (Cs)
Là lƣợng S. aureuscó trong 1 g thức ăn nấu từ thịt hoặc trứng.
Cs (CFU/g) TCVN: 4830- 1:2005 2 Khối lƣợng thức ăn đã ăn (m) Là khối lƣợng thức ăn đƣợc nấu từ thịt lợn hoặc trứng mà học sinh ăn trung bình trong 1 bữa ăn tại trƣờng
m (g) Phiếu điều tra
3 Tần suất ăn
Là số lần học sinh ăn thức ăn nấu từ thịt hoặc trứng trong 1