Cỏc phương phỏp sinh học phõn tử

CHƯƠNG 2 NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.2.5. Cỏc phương phỏp sinh học phõn tử

2.2.5.1. Tỏch chiết ADN theo phương phỏp của Saito Mura [142]

Nguyờn tắc: Thành tế bào của vi sinh vật được phỏ vỡ nhờ lyzozym và cỏc

chất tẩy mạnh như SDS-Tris-HCl giỳp ADN được giải phúng. Protein và ARN được tỏch ra khỏi ADN nhờ cỏc enzym ARN-aza, proteaza K và cỏc dung mụi Chloroform: isoamyl alcohol (24:1). Cuối cựng ADN được tủa bằng etanol tuyệt đối (lạnh -22) và xỏc định nồng độ ADN trong dịch mẫu.

Tiến hành: ADN được chiết xuất và tỏch từ sinh khối ướt theo phương phỏp

của Saito và Miura. Lấy 3 vũng que cấy sinh khối tế bào sau 14 giờ nuụi, ly tõm

lạnh ở 4oC với tốc độ 8.000 vũng trong15 phỳt và rửa 2 lần bằng 300l dung dịch

muối EDTA pH 8,0 (0.5M Na2EDTA, 0,15M NaCl). Sau đú tạo dịch huyền phự trở lại trong 200l đệm 10TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8,0, tỷ lệ mẫu:đệm,

1: 2). Bổ sung 10l lysozym (Sigma, 1mg/ml lysozyme), giữ ở 37oC trong nồi cỏch thuỷ trong 15 phỳt. Bổ sung dung dịch Tris-SDS (0,1M Tris-HCl pH 9,0 và 1%

SDS) với thể tớch bằng thể tớch mẫu. Dịch mẫu được giữ ở 60o C trong nồi cỏch thuỷ

khoảng 10-30 phỳt. Sự tan tế bào được xỏc định bằng độ trong của dung dịch cựng với sự tăng độ nhớt tương ứng. Dịch tan tế bào được làm lạnh trong đỏ 10 phỳt, bổ sung 150l cloroform-isoamyl alcohol (24:1, giữ ở 4oC) với thể tớch bằng 1/3 thể

tớch mẫu. Ly tõm lạnh ở 4oC với tốc độ 10.000 vũng trong 20 phỳt để phõn lớp. Sau

đú chuyển phần nhớt ở pha đầu sang eppendorf mới và ADN được tỏch nhờ bổ sung

etanol lạnh (etanol 95,5% giữ ở-22oC) với thể tớch gấp đụi thể tớch mẫu và 2l của

3M axetat-natri (pH=4.5). Ngõm ADN trong 100l etanol 70% trong 30 phỳt và sau đú ngõm liờn tiếp trong etanol 80, 90, 95% cho mỗi nồng độ trong 5 phỳt. Sợi ADN làm khụ ở nhiệt độ phũng trong 10 phỳt và được làm tan trở lại trong 20l đệm

0,1TE (10TE) ở 4oC qua đờm. Dịch đem phõn tớch bằng mỏy quang phổ kế ở cỏc

bước súng 230, 260 và 280nm. ADN hấp thụ rất nhanh ở bước súng 260nm. Ở bước súng 280nm chứng tỏ sự cú mặt của prụtờin. Bước súng 230nm biểu hiện sự cú mặt của chất đệm, cỏc muối như EDTA và của ARN. Cỏc tỷ lệ chuẩn về hấp thụ của ADN ở cỏc bước súng 230 : 260 : 280nm là 1,0: 0,45: 0,515. Hàm lượng ADN được tớnh như sau: 1 đơn vị OD (mật độ quang, Optical Durity) ở 260nm tương đương với 50g/ml ADN.

Cỏch tớnh: Đơn vị mẫu  độ loóng  chỉ số/1000 = ADN g/l.

Nếu ADN chưa sạch cần khử protein và ARN bằng enzym proteaza K và ARNaza

2.2.5.2. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)[23, 102,146,162]

Nguyờn tắc: Phương phỏp này sử dụng ADN polymeraza và cỏc

oligonucleotit tổng hợp nhõn tạo, một đoạn ADN dựng làm khuụn được nhõn lờn nhanh chúng với số bản sao gấp hàng tỷ lần mà khụng cần đến nhiều tế bào vi khuẩn. Nhờ phản ứng này một đọan gen bất kỳ sẽ được khuyếch đại khi biết được

trỡnh tự nucleotit ở hai đầu, ta đó tổng hợp được cặp mồi bổ sung với trỡnh tự của hai điểm từ đầu 5’ tới đầu 3’ của sợi bổ sung và nhờ cú enzym ADN polymeraza mà ADN khuụn được tổng hợp khi đó cú sẵn dNTP.

Tiến hành: Mỗi chu kỳ của phản ứng đũi hỏi 3 bước:

Biến tớnh (denaturation) sợi ADN bằng nhiệt độ ADN được tỏch thành hai sợi đơn. Nhiệt độ giảm xuống cho phộp mồi bắt cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN khuụn. Hỗn hợp ADN và mồi được ủ với enzym Taq polymeraza và dNTP giỳp cho việc tổng hợp ADN mới bổ sung với sợi ADN gốc. Khi cỏc chu kỳ được lặp lại, cỏc đoạn ADN vừa mới được tổng hợp ở cỏc chu kỳ trước trở thành khuụn cho chu kỳ sau. Số chu kỳ lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thường khụng quỏ 30 chu kỳ và mỗi phản ứng PCR thường kộo dài khoảng 2-3 giờ. Khi thực hiện phản ứng PCR, một số yếu tố ảnh hưởng đỏng kể đến kết quả của phản ứng như nồng độ mồi, nhiệt độ và

thời gian ủ mồi, nồng độ ADN khuụn, nồng độ một số ion, như Mg2+.

Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR.

Trỡnh tự mồi: Mồi xuụi 27 5’-agagtttgatcctggctcag-3’ 27-47

Mồi ngược 1525 5’-aaaggaggtgatccagcc-3’ 1525-

1507

dNTP (2,5mM) 2l

Mồi 1l (10pmol cho mỗi loại mồi (ngược và xuụi) 10 taq buffer 0,25l Nước cất 12l

Mẫu (50-90ng) 2l Taq polymeraza 0,3l (taq 5U/ml)

Tổng cộng thể tớch phản ứng 20 l

Chương trỡnh chạy PCR

Biến tớnh ADN ở 94oC trong 1 phỳt.

Chạy nhắc lại 30 chu kỳ tại: 94oC  1phỳt. 50oC  1 phỳt. 72oC  90 giõy. Hết một chu kỳ.

Tổng hợp : 72oC  2 phỳt.

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trờn gel agaroza

Pha đệm

Tiến hành pha dung dịch đệm 10  TAE

Tris 242g Axit axetic 57.1ml

0.5MEDTA. Na2 pH=8.0 100ml pha với một lớt nước

Trong quỏ trỡnh chạy điện di dựng dung dịch đệm 1TAE (của 10  TAE pha loóng dịch 10 trong 100 ml nước cất đó khử trựng).

Đổ gel.

- Cõn 0,8- 1,2 g agaroza cho vào 100ml dung dịch đệm 1TAE, đun sụi cho đến khi agaroza tan hết.

- Lắc đều để nguội đến 40-50oC. - Đổ gel vào khay đó cài sẵn lược.

- Để 30 phỳt cho tới khi bản gel cứng, rỳt lược và đặt khay gel vào mỏy điện di.

Tra mẫu:

- Dựng pipet hỳt 2l dung dịch ADN trộn với 2l 6  loading buffer.

- Tra 1l của 1 kb ADN ladder (Takara) trộn với 2l của 6  loading buffer dựng như ADN chuẩn.

- Tra mẫu vào từng giếng.

Chạy điện di với dũng điện 100V trong thời gian 20-30 phỳt cho tới khi vạch màu đến 2/3 bản gel.

Soi bản gel trờn mỏy soi UV của Bio-rad.

Kết quả ADN mới được nhõn lờn trong phản ứng PCR sẽ hiện hỡnh dưới những vạch đỏ màu da cam.

2.2.5.3. Phõn tớch trỡnh tự ADNr 16S theo phương phỏp của Sanger [23]

 Nguyờn tắc:

Dựa trờn trỡnh tự của đoạn mồi đặc hiệu để xỏc định trỡnh tự ADN của mẫu cần phõn tớch trực tiếp từ sản phẩm PCR.[55]

 Trỡnh tự 4 mồi: 27f 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 350f 5’-TACGGGAGGCAGCAG-3’ 350r 5’-CTGCTGCCTCCCGTAG-3’ 780f 5’-GATTAGATACCCTGGTAG-3’ 920r 5’-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3’ 1100f 5’-GCAACGAGGCGCAACCC-3’ 1100r 5’-AGGGTTGCGCTCGTTG-3’ 1 525r 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC- 3’ Tiến hành:

Tinh sạch sản phẩm PCR: Dựng Spinfilter unit (bộ kớt làm siờu sạch sản phẩm PCR), lấy 20l sản phẩm PCR cho vào Eppendorf, lọc qua spinfilter unit cú bổ sung 50l chất đệm spinbind sau đú loại bỏ dung dịch bằng siờu ly tõm tốc độ 13 000rpm trong 30 giõy. Spinfilter unit được rửa bằng 20l chất đệm spinclean, đem ly tõm 2 lần với tốc độ 13 000 vũng/phỳt trong 30 giõy. Sau đú spinfilter unit được cài vào một Eppendorf mới. Cuối cựng, tỏch sản phẩm ADN ra khỏi spinfilter unit bằng siờu ly tõm tốc độ 13000rpm trong 60 giõy cựng với 10l chất đệm rửa trụi.

- Xỏc định nồng độ ADN: Sản phẩm ADN sau được đo bằng cappilary cell bước súng 260nm và tớnh theo cụng thức: ADNABS 260  20  50ng/l.

- Sử dụng kit BigDye Terminator để xỏc định trỡnh tự ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR: lấy chừng 1l sản phẩm sạch PCR (từ 30 hoặc 90ng) làm ADN khuụn và 3,2pmol/l primer cho vào ống PCR (0.2ml, MicroAmp PCR), 2l BigDye, tổng

thể tớch 20l. Cỏc mẫu được làm biến tớnh ở 96oC trong 3 giõy rồi thực hiện 25 chu

kỳ theo chu trỡnh sau: 96oC trong 3 giõy, 50oC trong 5 giõy, 60oC trong 4 phỳt.

Bước cuối cựng ở 4oC, thời gian bảo quản.

- Tủa sản phẩm ADN đó nhuộm và gắn với Big Dye: Bổ sung 2l của 3M Na acetate (pH=4.5) và 500l của etanol. Ly tõm tốc độ 15000 vũng/phỳt trong 30 phỳt. Sau đấy mẫu được rửa hai lần trong 500l của 70% etanol, loại bỏ etanol dựng ly tõm 15000 vũng/phỳt trong 5 phỳt. Làm khụ mẫu bằng thiết bị khụ chõn khụng

trong 5 phỳt. Cuối cựng bổ sung 15l Hi - Dye formamit cho việc tỏch rời cỏc nucleotit và trộn nhẹ nhàng trong 1 phỳt, làm biến tớnh trong nước sụi 2 phỳt.

Làm lạnh ngay trong nước đỏ khoảng 5 phỳt. 10l mẫu tra vào giếng của khay mẫu và được phõn tớch trong thiết bị đọc trỡnh tự tự động ABI Prism 3100 Avant.