CHƯƠNG 2 NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.2. Phõn lập và tuyển chọn xạ khuẩn
2.2.2.1. Phõn lập xạ khuẩn theo Vinogradski
Cõn 1g đất cho vào bỡnh nún 50ml chứa 9ml nước cất vụ trựng, lắc trờn mỏy lắc 30 phỳt. Dựng pipet vụ trựng hỳt 0,5ml dịch đất sang ống nghiệm cú chứa 4,5ml nước vụ trựng và tiếp tục pha loóng đến 10-2, 10-3, ... , 10-6 . Từ mỗi nồng độ pha
loóng ở cỏc nồng độ 10-3 đến 10-6 , nhỏ 0,1ml sang đĩa Petri chứa mụi trường ISP4.
Dựng que gạt vụ trựng trang đều sau đú nuụi ở nhiệt độ phũng từ 4-7 ngày. Trờn mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của xạ khuẩn được cấy 3 pha sang đĩa Petri chứa mụi trường ISP4 để làm sạch. Sau đú nuụi ở nhiệt độ phũng từ 4 -7 ngày, từ cỏc khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa mụi trường thạch nghiờng ISP- 4 và Gauze I tiếp tục nuụi ở điều kiện trờn trong 10-14 ngày. Theo ISP màu sắc khuẩn ty khớ sinh của cỏc chủng xạ khuẩn được chia thành 8 nhúm màu: White (W) nhúm trắng, Gray (Gy) nhúm xỏm, Red (R) nhúm đỏ, Yellow (Y) nhúm vàng, Green (Gn) nhúm xanh, Blue (B) nhúm xanh da trời, Violet (V) nhúm tớm, và nhúm màu khụng xỏc định (X) [7,8, 176]
2.2.2.2. Xỏc định hoạt tớnh khỏng sinh
Phương phỏp thỏi thạch (dựng để sơ tuyển xạ khuẩn) [4]
Xạ khuẩn được nuụi cấy trờn mụi trường ISP 4 và Gauze I trong hộp Petri sau 7 ngày dựng khoan nỳt chai khoan cỏc thỏi thạch đặt vào hộp Petri đẫ cấy vi sinh vật kiểm định. Để vào tủ lạnh 4-5h cho CKS khuếch tỏn vào mụi trường thạch sau
đú để vào tủ ấm. Vi khuẩn kiểm định nuụi ở 370C, nấm men và nấm mốc nuụi ở 28-
thước vũng vụ khuẩn ( D - d, mm ), D là kớch thước vũng vụ khuẩn và d là đường kớnh thỏi thạch.
Phương phỏp đục lỗ (Xỏc định hoạt tớnh khỏng sinh trong dịch thể) [4]
Dựng khoan nỳt chai đục cỏc lỗ trờn mụi trường thạch đó cấy vi sinh vật kiểm định trong hộp Petri. Nhỏ vào cỏc lỗ khoan dung dịch cần thử (cỏc bước tiếp theo tiến hành như phương phỏp thỏi thạch).
Phương phỏp khoanh giấy lọc (Xỏc định hoạt tớnh khỏng sinh trong dung mụi).
Khoanh giấy lọc F8 cú đường kớnh 6mm được tẩm một lượng dịch CKS
(1ml/10 khoanh giấy lọc). Sau đú sấy khụ ở 400C. Đặt khoanh giấy lọc đó tẩm CKS
vào hộp Petri đó cấy vi sinh vật kiểm định. (Cỏc bước tiếp theo giống phương phỏp thỏi thạch).
2.2.2.3. Tuyển chọn cỏc chủng xạ khuẩn sinh chất khỏng sinh [4]
Từ ống thạch nghiờng giống đó hoạt hoỏ được cấy truyền sang cỏc binh nún dung tớch 250 ml chứa 100 ml mụi trường Gauze I và nuụi lắc 220 vũng/ phỳt trong 48 giờ ở nhiệt độ phũng.
Giống phỏt triển tốt được cấy truyền với tỷ lệ 10% sang binh nún dung tớch 250 ml chứa 80 ml mụi trường Gauze I dịch thể. Quỏ trỡnh lờn men kộo dài 96 giờ ở nhịờt độ phũng trờn mỏy lắc 220 vũng/ phỳt. Sau đú thử hoạt tớnh khỏng sinh trong dịch lọc.