CHƯƠNG 2 NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. NGUYấN LIỆU VÀ HOÁ CHẤT
2.1.1. Nguyờn liệu
2.1.1.1. Mẫu cõy
Mẫu nghiờn cứu là cỏc đối tượng cõy trồng bị bệnh khỏc nhau (cõy cụng nghiệp ngắn ngày, cõy lương thực, cõy ăn quả, cõy rau và cỏc loại quả tươi bị nhiễm mốc tự nhiờn). Cỏc mẫu được thu thập tại những địa điểm khỏc nhau: Hà Tõy, Bắc Ninh, Viện Rau Quả, Trường Đại học Nụng Nghiệp I, Hà Nội theo thời vụ trong năm 2003.
2.1.1.2. Mẫu đất
71 mẫu đất được lấy từ độ sõu 5 10 cm ở cỏc địa hỡnh khỏc nhau: đất nỳi, đất bói trong và ngồi đờ, đất ruộng lỳa, đất vườn ở một số vựng khỏc nhau trờn cả nước. Từ đú đó phõn lập được 508 chủng xạ khuẩn.
2.1.1.3. Vi sinh vật kiểm định
- Staphylococus aureus nhận được từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Hà Nội
- Pseudomonas solanacearum nhận được từ Viện KHKT Nụng Nghiệp. - Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Penicillium nhận được từ Bộ mụn Bệnh cõy và Trung tõm Bệnh cõy nhiệt đới, trường Đại học Nụng Nghiệp I Hà Nội.
- Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococus aureus ATCC 9347, Shigella
flemeri, Salmonella typhi DT, Escherichia coli ATCC 15224, Candida albicans,
Candida tropicalis, Trichophyton mentagrophytes, Fusarium oxysporum
VCM3081, Aspergillus niger VCM3004, nhận được từ Bảo tàng giống chuẩn Trung tõm Cụng nghệ Sinh học, ĐH Quốc gia Hà Nội và Viện Da liễu, Bộ Y Tế.
- Cỏc loại đường chuẩn: glucoza, arabinoza, raffinoza, fructoza, lactoza, xyloza, inositol, saccaroza, cỏc loại dung mụi: metanol, butanol.... do hóng Merk sản xuất (Đức).
- Cỏc dung mụi: n-butanol, etanol, etyl-acetat, iso-propanol, metanol, aceton của Trung Quốc.
- Validamyxin A chuẩn do Cục Bảo vệ thực vật cung cấp.
- Proteaza K, Tag polymeraza, Merck Đức.
- Deoxynucleosit triphotphat, carboxymethyl cenloloza, Sigma, Mỹ - Mexyl MZ 72 WP (cụng ty thuốc trừ sõu Sài Gũn)
- Rovral 50WP ( Aventis Crob Science Việt Nam) [19] - Validacin 3DD ( Cty thuốc bảo vệ thực vật I) [1]
- Cỏc hoỏ chất cũn lại đều đạt độ tinh khiết dành cho phõn tớch.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
Cõn điện 0,001g Thụy Điển
Kớnh lỳp soi nổi dựng điện Nhật Bản
Kớnh hiển vi quang học OLYMPUS Nhật Bản
Tủ thổi khớ vụ trựng Anh
Mỏy đo pH Delta 320 Nhật
Kớnh hiển vi điện tử quột JEOL Nhật
Mỏy đo quang phổ tử ngoại (UV-VIS Spectrophotometer Cary IE-Varian): Úc Mỏy đo phổ hồng ngoại (FT-IR Spectrophotometer 1650-Perkin Elmer, HP) Mỹ
Mỏy HPLC (Azilent 1100, HP) Mỹ
Mỏy sequencing ABI Prism 3100 Avant Mỹ Mỏy NMR Brucker-400MHz Đức Khổ phối 5989-MS
2.1.4. Cỏc cụng thức mụi trường
Mụi trường khoai tõy (PDA-Potato Dextrose Agar) (g/l): Khoai tõy miếng - 200, thạch - 18, đường - 20, nước 1lit, pH 7 - 7,4.
- Mụi trường WA (Water Agar): đun 15g WA trong 800ml nước cho tan thạch. Bổ sung nước cho đủ 1000 ml. Hấp khử trựng ở 121oC trong 20 phỳt, để nguội khoảng 40oC rồi rút ra đĩa Petri.
- Đặt 3 - 4 mảnh/ đĩa, rút mụi trường WA đó khử trựng vào đĩa Petri
Mụi trường CZ (Czapek–Dox–Agar) (g/l): NaNO3-2; KH2PO4 -1;
MgSO4.7H2O - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; thạch - 20; nước -1 lớt
Mụi trường phõn lập, giữ giống và nghiờn cứu xạ khuẩn:
Mụi trường ISP - 4 (g/l): tinh bột tan - 10; K2HPO4 - 1,0; MgSO4.7H2O - 1,0; NaCl - 1,0; (NH4 )2SO4 - 2; CaCO3 - 2; nước - 1 lit; dung dịch khoỏng - 1ml; pH 7- 7,2; thạch - 18g.
Dung dịch khoỏng cú thành phần (g/100ml nước); FeSO4.7H2O-0,1; MnCl2.4H2O - 0,1; ZnSO4.7H2O - 0,1.
Mụi trường Gauze I (g/l): tinh bột tan - 20; K2HPO4 - 0,5; MgSO4.7H2O - 0,5; NaCl - 0,5; (NH4)2SO4 - 2; KNO3 - 0,5; FeSO4 - 0,01; nước - 1lit; pH 7 - 7,4; thạch 18g.
Mụi trường giữ giống: cú thờm (g/l): pepton - 5; cao nấm men - 10.
Mụi trường Gauze II (g/l): Nước chiết thịt - 30ml; pepton - 5; NaCI - 5; glucoza -10; thạch - 18; nước - 1lit, pH 7 - 7,4.
Mụi trường ISP-I (g/l): Tryton - 5, cao nấm men - 3, thạch - 18, nước 1lit, pH 7 -7,2.
Mụi trường ISP-2 (g/l): cao nấm men - 4; cao malt - 10; dextroza - 4; nước cất 1 lit, thạch - 18, pH 7 - 7,3.
Mụi trường ISP- 6 (g/l): Pepton - 10, cao nấm men - 1, xitrat sắt - 0,5, thạch - 18, nước - 1lit, pH 7 - 7,2.
Mụi trường ISP-9 ( g/l): (NH4)2SO4 - 2,64; KH2PO4 - 2,38; K2HPO4 - 5,65; MgSO4 - 1; dung dịch muối B - 1 ml; nguồn cacbon - 10; thạch - 20; nước - 1lit; pH 6,8 - 7.
Mụi trường 79 (g/l): glucoza - 10, pepton - 10, cazein thuỷ phõn - 2, cao nấm men - 2, NaCI - 6, K2HPO4 - 0,2, thạch - 18, nước 1lit, pH 7 - 7,4.
Mụi trường A-4H (g/l): glucoza - 15; bột đậu tương - 15; NaCl - 5; CaCO3 -1; nước - 1lớt; pH 7.
Mụi trường A-4 (g/l): glucoza - 10; bột đậu tương - 10; NaCl - 5; CaCO3 - 1; nước 1lớt; pH 7.
Mụi trường A-9 (g/l): glucoza-10; rỉ đường - 20; pepton - 5; nước - 1 lớt; pH 7. Mụi trường A-12 (g/l): tinh bột tan - 10; rỉ đường - 10; bột đậu tương - 10; KH2PO4 - 2; CaCO3 - 1; NaCl - 5; nước - 1lớt; pH 7.
Dung dịch muối khoỏng A
- Dung dịch muối khoỏng cơ sở (g/l): K2HPO4 - 3 ; MgSO4 - 3 ; NaCl - 3 ; CaCO3 - 6; nước cất 1000 ml .
- Dung dịch muối khoỏng vệt (g/l): CuSO4 - 6,4; FeSO4 - 1,1; MnCl2 - 7,9; nước cất 1000 ml.
- Cỏch làm : Lấy 30ml dung dịch muối khoỏng cơ sở và 0,1ml dung dịch muối khoỏng vệt phõn vào bỡnh nún 250ml. Bổ sung thờm 20ml nước cất sao cho mỗi bỡnh cú 50ml dung dịch hỗn hợp muối (dung dịch muối A) chỉnh pH 7.
Dung dịch muối B (%): CuSO4 - 0,64; FeSO4 - 0,11; MgCl2 - 0,79; nước – 100ml.
Cỏc mụi trường lờn men xốp:
Mụi trường: Gạo + Dịch khoỏng Mụi trường: Gạo + Nước
Mụi trường: Bột gạo + Trấu + Bột đậu tương Mụi trường: Bột đậu tương + Trấu
Mụi trường: Bột gạo + Trấu