SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.4. SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN

1.4.1. Cỏc yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất khỏng sinh

Vi sinh vật tồn tại trong tự nhiờn sinh ra cỏc sản phẩm trao đổi chất và cỏc thành phần tế bào chỉ ở mức độ cần thiết cho sự sinh sản và sự duy trỡ loài. [42]. Những quỏ trỡnh lờn men cụng nghiệp phải chọn hoặc tỡm ra được những cỏ thể cú khả năng sinh tổng hợp cỏc sản phẩm mong muốn với năng suất cao. Trong việc tối ưu húa cỏc quỏ trỡnh lờn men cụng nghiệp, cần phải tỡm ra trạng thỏi sinh lý để cú năng suất cao nhất và duy trỡ trong một thời gian dài [42,43]. Vấn đề kinh tế chủ yếu đối với một quỏ trỡnh lờn men là làm sao từ cơ chất ban đầu, trong một thể tớch nồi lờn men nhỏ tới mức cho phộp, trong một thời gian ngắn cú thể đạt tới mức thu hoạch cao đối với cỏc sản phẩm mong muốn. Để cú được kết quả đú cần phải xỏc định cỏc thụng số cần thiết cho sự phỏt triển và hỡnh thành tối ưu sản phẩm của quỏ trỡnh sinh tổng hợp.

1.4.1.1. Thành phần mụi trường lờn men

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon thường là cỏc đường đơn: glucoza, fructoza... hay cỏc loại đường đụi như: sacaroza, maltoza, lactoza... hoặc cũng cú thể là cỏc loại tinh bột,

cỏc chất cú thành phần khụng xỏc định như rỉ đường [7,8,53]. Trong tất cả cỏc nguồn cacbon thỡ glucoza là nguồn cacbon dễ tiờu hoỏ, nhưng nú thường gõy nờn hiện tượng kiềm chế dị hoỏ trong tổng hợp CKS ở một ngưỡng nồng độ nào đú [99]. Tuy nhiờn ta cú thể khắc phục đuợc hiện tượng này bằng cỏch bổ sung liờn tục một lượng nhỏ glucoza theo định kỳ, mà khụng dẫn đến tớch lũy cỏc chất trao đổi ức chế, nhờ đú cú thể tiến hành sản xuất CKS từ nguồn cacbon là glucoza.[40,68].

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ, tồn tại ở hai dạng vụ cơ và hữu cơ. Nguồn nitơ hữu cơ gồm: cao ngụ, cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tương... Nguồn nitơ vụ cơ thường dựng

ở dạng muối amụn(NH4+) hoặc nitrat (NO3-), song thụng thường quỏ trỡnh sinh tổng

hợp CKS đũi hỏi cả hai nguồn nitơ trong mụi trường. [88]. Nguồn và nồng độ nitơ trong mụi trường nuụi cấy ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp CKS. Sự dư thừa cỏc amon hay cỏc nitơ chuyển húa nhanh khỏc sẽ ức chế sinh tổng hợp của nhiều chất khỏng sinh như erythromixin, leucomixin, novobioxin…[53,78,99]. Tỏc dụng ngược của nguồn nitơ dễ tiờu (amon) cú thể được loại trừ khi bổ sung Mg3(PO4)2 vào mụi trường. Sự hỡnh thành CKS của mỗi chủng đũi hỏi tỷ lệ C/N nhất định.

Ảnh hưởng của nguồn photpho vụ cơ

Bờn cạnh nguồn C và N thỡ photphat vụ cơ được xem như là yếu tố tham gia điều chỉnh sinh tổng hợp CKS ở xạ khuẩn [182]. Nồng độ photphat thớch hợp cho tổng hợp CKS thường khụng vượt quỏ 10mg/ml [44]. Nồng độ photphat cao sẽ làm tăng tổng hợp axit nucleic trong tế bào, do đú rỳt ngắn pha tổng hợp và kộo dài pha dinh dưỡng, hoặc lượng photphat dư thừa sẽ ức chế quỏ trỡnh tổng hợp cỏc enzym tham giam vào tổng hợp enzym [44,52]. Tuy nhiờn cũng cú những ngoại lệ như sinh tổng hợp nocaxidin bởi Nocardia uniformic lại cần một nồng độ photphat vụ cơ cao 100-200 g/ml [7,16, 182].

1.4.1.2. Điều kiện nuụi cấy

Xạ khuẩn là vi khuẩn hiếu khớ, cú nhu cầu thụng khớ cao hơn so với cỏc vi sinh vật khỏc, nhất là trong giai đoạn nhõn giống. Do đú yếu tố thụng khớ cú ảnh hưởng quyết định đến sinh tổng hợp CKS. Đối với hàng loạt CKS thỡ độ thụng khớ để đạt hiệu suất cực đại là lưu lượng thổi khớ 1v/v/phỳt.

 Nhiệt độ

Hầu hết xạ khuẩn phỏt triển tốt ở nhiệt độ 28  300C. Nhiệt độ thớch hợp cho

sự tổng hợp CKS cũn phụ thuộc vào từng chủng sản. Vớ dụ chủng S.griseus nhiệt độ

tối ưu cho sản xuất CKS streptomyxin là 260C, nhiệt độ ức chế sản xuất là 30, cũn

S.rifamices thỡ nhiệt độ tối ưu cho sản xuất lại là 190C, nhiệt độ ức chế là 270C. [7].

 pH mụi trường

Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc rất lớn vào pH mụi trường. pH thớch hợp cho sinh tổng hợp CKS thường là pH trung tớnh. pH axit hay kiềm đều ức chế quỏ trỡnh tổng hợp CKS. Bởi vậy mà trong hệ thống nồi lờn men, thường thiết kế bộ phận điều chỉnh pH tự động bằng HCl và NaOH [44,182].

 Chất lượng bào tử và giống sinh dưỡng

Thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp CKS khụng chỉ phụ thuộc vào điều kiện lờn men mà cũn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng, nghĩa là vào tuổi và khả năng đồng đều về mặt di truyền cựng hoạt tớnh trao đổi chất của chủng giống phản ỏnh điều kiện nuụi cấy.[41].

Tuổi của giống cho hiệu suất CKS cao nhất là 24 giờ tuổi, tuy nhiờn thời gian nuụi cũn phụ thuộc vào từng chủng và tuổi của bào tử giống. Tỷ lệ giống vào mụi trường lờn men phụ thuộc vào chủng xạ khuẩn và thành phần mụi trường nhõn giống (thường là từ 2 - 10%).

Cỏc phũng thớ nghiệm hiện nay trờn thế giới đó cú rất nhiều phương phỏp để lựa chọn cỏc điều kiện lờn men thớch hợp cho quỏ trỡnh sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS của chủng sản. Chẳng hạn nhúm nghiờn cứu của Duetz đó dựng phương phỏp

96 giếng , đõy là phương phỏp cú nhiều ưu việt hơn, tuy nhiờn khụng cú một mụ hỡnh chuẩn nào cho việc lựa chọn cỏc điều kiện tối ưu cho sự tạo thành cỏc sản phẩm bậc 2 ở vi sinh vật. [106]

1.4.2. Cụng nghệ lờn men CKS – Quỏ trỡnh sau lờn men (Downstream Processing) Processing)

Đõy là một thuật ngữ thường dựng để mụ tả quỏ trỡnh tinh sạch cỏc sản phẩm đó được tạo thành trong thời gian lờn men nhờ vi sinh vật. Quỏ trỡnh này gồm cỏc bước: tinh sạch sản phẩm, phõn tớch kinh tế, tạo sản phẩm ở quy mụ lớn. Việc thu hồi và xỏc định cỏc sản phẩm cú phõn tử nhỏ (300-800 MW), đặc biệt là cỏc sản phẩm bậc hai, là bước nghiờn cứu quan trọng. [46]

Sản xuất CKS thường được tiến hành theo phương phỏp lờn men chỡm trong nồi lờn men cú khuấy liờn tục và sục khớ. Cú hai hỡnh thức lờn men: lờn men theo mẻ và lờn men liờn tục, được mụ tả trong tài liệu [46]. Cấu tạo nồi lờn men phải đảm bảo tạo điều kiện lờn men tối ưu: độ thụng khớ, nhiệt độ nuụi, pH…

Hai yếu tố quan trọng nhất trong quỏ trỡnh sau lờn men là: đặc tớnh sinh lý của phõn tử cần được tỏch chiết và tinh sạch (đú là trọng lượng phõn tử (MW), sự phõn cực của phõn tử, sự tớch điện của cỏc ion) và nồng độ của chất cần tinh sạch cú trong dịch nuụi cấy. Nhỡn chung, đặc tớnh lý húa của phõn tử cú thể xỏc định nhờ một số phương phỏp sắc ký như: trao đổi ion, lọc gel, tỏch phõn lớp hay phương phỏp hấp phụ. Nồng độ của phõn tử cần xỏc định cú trong dịch lờn men thường rất ớt, đối với một chủng hoang dại khi lờn men thỡ nồng độ CKS thường từ 0,1- 10g/ml. Cũn đối với một quỏ trỡnh lờn men chuẩn thỡ nồng độ là 300-600g/ml. Tựy theo khả năng sinh khỏng sinh của từng chủng sản, nhưng khoảng 5-10 L dịch lờn men là cú thể đủ cho việc xỏc định phổ hấp phụ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR) và sắc ký lỏng cao ỏp (HPLC), phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR) và cỏc dữ liệu về cấu trỳc phõn tử trong database.[46,48]

1.4.3. Sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp CKS

Quỏ trỡnh sinh tổng hợp CKS xẩy ra theo hai pha điển hỡnh. Pha sinh trưởng (trophophase) sử dụng cỏc thành phần chủ yếu của mụi trường, tăng sinh khối và pha sinh tổng hợp (idiophase). Sự tạo thành sản phẩm thường vào giai đoạn cuối của pha sinh trưởng, tuy nhiờn điều này lại hoàn toàn phụ thuộc vào từng chủng giống sinh khỏng sinh. Sinh trưởng chậm lại đụi khi xuất hiện quỏ trỡnh tự tan của khuẩn ty và sinh tổng hợp CKS mạnh.[98]. Hoạt tớnh sinh tổng hợp bị giới hạn thường là do cạn kiệt chất dinh dưỡng trong mụi trường và sự thay đổi pH. Nồng độ của nguồn cacbon, nitơ và pH mụi trường cũng cú thể điều khiển sự phỏt triển của chủng sản ở trạng thỏi hoạt động, và chỳng ta cú thể kộo dài pha sinh tổng hợp bằng cỏch giữ cỏc yếu tố này ở mức độ thớch hợp [16,21,31,38].

1.4.3.2. Sự hỡnh thành và sinh tổng hợp CKS

Cú nhiều quan điểm khỏc nhau về khả năng hỡnh thành CKS và vai trũ của chỳng đối với bản thõn xạ khuẩn trong tự nhiờn. Một số tỏc giả cho rằng sự hỡnh thành CKS là cơ chế giỳp cho vi sinh vật tồn tại trong mụi trường tự nhiờn. Một số khỏc lại cho rằng, sự hỡnh thành CKS là do sự cạnh tranh trong mụi trường dinh dưỡng [46]. Thường cỏc CKS khụng cú một chức năng rừ rệt đối với tế bào sản sinh ra chỳng [26]. Chỳng khụng tham gia vào quỏ trỡnh trao đổi chất nờn sự mất khả năng hỡnh thành CKS khụng làm mất khả năng sinh trưởng [115]. Lại cú quan điểm cho rằng CKS chỉ là sản phẩm thải ra của quỏ trỡnh trao đổi chất của tế bào [44].

Trong điều kiện tự nhiờn xạ khuẩn chỉ hỡnh thành một lượng rất nhỏ cỏc CKS, thường khụng quỏ 50mg/l mụi trường nuụi cấy [21, 37,42, 46].

Mặc dự CKS cú cấu trỳc khỏc nhau và các vi sinh vật tạo ra chỳng cũng rất đa dạng, nhưng quỏ trỡnh sinh tổng hợp chỳng dường như theo một số con đường nhất định. Cỏc con đường này chỉ là sự cải biờn cỏc con đường sinh tổng hợp của tế bào. Cỏc vật liệu ban đầu của quỏ trỡnh chuyển húa thứ cấp (CKS) là những chất trao đổi sơ cấp.[41].