CHƯƠNG 2 NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.7. Tỏch chiết và tinh chế chất khỏng sinh
2.2.7.1. Tỏch chiết chất khỏng sinh từ sinh khối bằng dung mụi hữu cơ
Sau khi lờn men dịch nuụi cấy và sinh khối được tỏch riờng. Phần sinh khối được chiết bằng cỏc loại dung mụi khỏc nhau, với tỷ lệ chiết là 1:1. Hỗn hợp dung mụi sinh khối nay được lắc 30 phỳt ở nhiệt độ phũng, sau đú ly tõm loại sinh khối. Cuối cựng dung mụi chiết được thử hoạt tớnh khỏng sinh trờn VSV kiểm định bằng phương phỏp khoanh giấy lọc.
2.2.7.2. Tỏch chiết chất khỏng sinh từ dịch lờn men bằng dung mụi hữu cơ
CKS trong dịch lờn men cú thể được tỏch bằng nhiều phương phỏp khỏc nhau như: hấp phụ, trao đổi ion hay tỏch chiết bằng cỏc dung mụi hữu cơ. Dịch lờn men sau khi loại sinh khối cú thể được tỏch bằng cỏc loại dung mụi hữu cơ khỏc nhau như: n-butanol, etyl axetat... tỷ lệ giữa dịch chiết và dung mụi là 1:1. Hỗn hợp dịch lờn men và dung mụi được lắc ở nhiệt độ phũng trong 30 phỳt. Sau đú thử hoạt tớnh khỏng sinh trong dung mụi và trong dịch chiết bằng phương phỏp khoanh giấy lọc.
2.2.7.3. Tỏch chiết chất khỏng sinh bằng nhựa trao đổi ion [70,71,179]
Dịch nuụi cấy Streptomyces hygroscopicus TC-54 được axit húa bằng axit
oxalic về pH 4,5. Cỏc ion Ca+ trong dịch nuụi cấy được loại bỏ nhờ quỏ trỡnh lọc.
Xử lý dịch lọc bằng Ambelit IR-120 (H) và IR-45(OH) để loại bỏ cỏc gốc
H+ và OH- bẩn.
Nhồi cột Dower-50 X-2 (H). CKS hấp thụ trong nhựa Dower-50 X-2 (H)
được giải hấp thụ bằng NH4OH 0,5N.
Thu được CKS dạng thụ.
2.2.7.4. Định tớnh khỏng sinh bằng sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography -TLC) [70]
Chuẩn bị bản mỏng: cõn 1 g Silicagel G cho vào cối nghiền mịn, thờm 10ml nước cất. Nghiền nhanh rồi trỏng lờn tấm kớnh kớch thước 10x20 cm để khụ ở nhiệt
độ phũng, sau đú hoạt húa trong tử sấy 1100C/1giờ để nguội bỏa quản trong bỡnh
hỳt ẩm. Bản mỏng trỏng Silica gel GF254(Merck, Germany) được hoạt húa ở 1100C
trong 1 giờ.
Cỏc chất khỏng sinh cần xỏc định được chạy trong bản silica gel G khai triển trong hệ dung mụi n-propanol-axit axetic-nước (4:1:1). Kiểm tra bằng thuốc thử naphthoresorcin-H2SO4 hoặc bằng hiện hỡnh sinh học.