Nghiờn cứu cỏc đặc điểm sinh học và phõn loại xạ khuẩn

CHƯƠNG 2 NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU

2.2.4. Nghiờn cứu cỏc đặc điểm sinh học và phõn loại xạ khuẩn

2.2.4.1. Đặc điểm hỡnh thỏi

a) Quan sỏt hỡnh thỏi cuống sinh bào tử [113,134, 177]

Xạ khuẩn được nuụi cấy trờn mụi trường Gauze I cú găm lamen nghiờng

450 trờn bề mặt mụi trường. Sau 7-9 ngày nuụi ở nhiệt độ phũng lấy ra quan sỏt hỡnh

dạng chuỗi sinh bào tử trờn lamen dưới kớnh hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử cú cỏc dạng thẳng hay hơi lượn súng kớ hiệu là RF (Rectiflexibiles), hỡnh múc cõu hay hỡnh xoắn khụng hoàn toàn ký hiệu là RA (Retinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spirales).

b) Bề mặt bào tử

Dựng màng cacbon đặt trực tiếp lờn bề mặt khuẩn ty khớ sinh cú bào tử, sau đú quan sỏt và chụp ảnh dưới kớnh hiển vi điện tử quột.

Bào tử cú hỡnh dạng: trũn, ovan, elip, hỡnh que [113]

Bề mặt bào tử xạ khuẩn cú cỏc dạng: Nhẵn ký hiệu là Sm (Smooth), dạng mụn cúc ký hiệu là Wa (Warty), dạng gai ký hiệu là Sp (Spiny) và dạng túc ký hiệu là Ha (Hairy).

2.2.4.2. Đặc điểm nuụi cấy

a) Màu sắc khuẩn ty khớ sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan [113,154]

Xạ khuẩn được nuụi cấy trờn mụi trường: Gauze I, Gauze II, ISP-2, ISP-4, 79 và khoai tõy (KT) ở nhiệt độ phũng. Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sỏt màu khuẩn ty khớ sinh (KTKS ), khuẩn ty cơ chất (KTCC) và sắc tố tiết ra mụi trường.

b) Sự hỡnh thành sắc tố melanin [113]

Xạ khuẩn được nuụi cấy trờn mụi trường ISP- 6 ở nhiệt độ phũng. Bắt đầu quan sỏt màu của mụi trường sau 24 giờ cho đến ngày thứ 14. Nếu sinh melanin, màu của mụi trường sẽ chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nõu đậm cho đến màu đen.

2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý sinh hoỏ

Xạ khuẩn cấy trờn mụi trường thạch nghiờng Gauze I và nuụi ở cỏc nhiệt độ: 250C, 280C, 370C. Khả năng sinh trưởng được xỏc định sau 7-10 ngày nuụi.[182]

b) Khả năng sinh enzym ngoại bào [27].

Xỏc định hoạt tớnh cỏc enzym ngoại bào bằng cỏch nuụi xạ khuẩn trờn mụi trường chứa cơ chất dựng để xỏc định hoạt tớnh enzym.

- Tinh bột tan (xỏc định hoạt tớnh amylaza).

- Cazein (xỏc định hoạt tớnh proteaza ).

- CMC (xỏc định hoạt tớnh endoglucanaza).

- Gelatin (xỏc định hoạt tớnh gelatinaza ).

c) Khả năng chịu muối

Cấy xạ khuẩn trờn mụi trường thạch nghiờng ISP- I cú bổ sung thờm NaCI với cỏc nồng độ 0,5; 1; 3; 5; 7; 8; 9; 10; 11 và 12 (%), sau 7-10 ngày lấy ra quan sỏt sự sinh trưởng.

d) Khả năng sử dụng cỏc nguồn cacbon [113]

Xạ khuẩn được nuụi cấy trờn mụi trường ISP-9 cú bổ sung 1% cỏc nguồn đường: Glucoza, manitol, maltoza, raffinoza, arabinoza, inostol, fructoza, lactoza, sacaroza, xyloza, xitrat natri, rhamnoza.

Cỏch làm: cõn 1g đường, thanh trựng bằng đốn UV rồi bổ sung vào 100 ml mụi trường ISP-9 cũn núng. Lắc cho tan đường rồi đổ vào đĩa Petri và nuụi cấy xạ khuẩn, sau 14 ngày quan sỏt sự sinh trưởng.

Trong đú mụi trường cú glucoza được coi là đối chứng dương (+) và mụi trường khụng cú đường được coi là đối chứng õm (-).

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng hoặc kộm hơn đối chứng dương một ớt: cú khả năng sử dụng loại đường đú, kớ hiệu là (+).

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương, kớ hiệu là (++).

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng bằng đối chứng õm hoặc khụng mọc: khụng cú khả năng sử dụng loại đường đú , kớ hiệu là (-).

- Nếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng õm một ớt nhưng kộm hơn đối chứng dương nhiều, kớ hiệu là ().

e) Xỏc định axit diaminopimelic (DAP) của xạ khuẩn [146,161]

Nguyờn tắc: Ninhydrin phản ứng với nhúm -NH2 của axit diaminopimelic ở

100oC. tạo ra sản phẩm là cỏc vệt mầu tớm đỏ.

Tiến hành: Cho khoảng 50mg tế bào ướt vào ống thuỷ tinh cú nỳt vặn (cỡ

3mm100mm). Thuỷ phõn tế bào bằng 1ml 6N HCl ở 100oC trong 16 giờ tại nồi ổn

nhiệt khụ. Làm lạnh dịch thuỷ phõn tới nhiệt độ phũng.

Bổ sung 2ml nước cất vụ trựng. Loại bỏ phần cặn cựng giấy lọc. Chấm chừng 3 l dung dịch lờn giấy sắc ký bản mỏng. Dựng 1l của 0,01M LL- diaminopimelic acid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) làm dung dịch chuẩn. Đặt giấy sắc ký bản mỏng trong bồn thuỷ tinh chứa 50ml hỗn hợp metanol - nước - 6N HCl - pyridine (80:26:4:10, v/v) trong 3 giờ hoặc lõu hơn. Phun dung dịch 0,2% ninhydrin (trong nước bóo hồ n - butanol) lờn giấy sắc ký bản mỏng, đặt trong tủ

sấy ở nhiệt độ 100oC trong 5 phỳt). Vết LL- DAP tỏch rời, xuất hiện từ TLC như là

cỏc vết màu tớm đỏ. LL-DAP (Rf 0,29), meso-DAP (Rf 0,24).