CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ CHẤT KHÁNG SINH
Tinh sạch cỏc chất trao đổi từ vi sinh vật là một quỏ trỡnh phức tạp, đũi hỏi rất nhiều kỹ thuật, do cỏc chất này rất đa dạng về cấu trỳc hoỏ học nờn trọng lượng phõn tử rất khỏc nhau. Chỳng cú thể tan trong nước hay tan trong cỏc dung mụi hữu cơ tuỳ theo đặc tớnh của từng chất. Thường những chất tan trong dung mụi hữu cơ dễ tinh sạch hơn tan trong nước. Những chất khú tinh sạch nhất là những chất dễ tan trong nước, trung tớnh hoặc lưỡng tớnh. Phương phỏp trao đổi ion rất hiệu quả đối với những chất tan trong nước axit hoặc kiềm và khụng hiệu quả đối với những chất tan trong dung mụi hữu cơ. Sắc ký lỏng cao ỏp là phương phỏp rất hữu dụng trong việc tỏch chiết cỏc chất trao đổi từ vi sinh vật.[21,32,95]
1.5.1. Tỏch chiết CKS từ hệ khuẩn ty
Chiết rỳt là phương phỏp thớch hợp nhất để tỏch chiết CKS ra khỏi hệ sợi. Hiệu quả càng cao nếu khả năng hũa tan của CKS trong tỏc nhõn chiết càng lớn. Do vậy khả năng tỏch chiết phụ thuộc vào tỷ lệ hũa tan của chất dựng để chiết đối với pha rắn, tỷ lệ khuếch tỏn của cỏc hợp chất trong pha lỏng và tỷ lệ chuyển dịch của cỏc chất vào trong chất tỏch chiết. Trước khi tỏch chiết, sinh khối cần được rửa bằng nước để loại bỏ cỏc thành phần cũn sút của mụi trường. Metanol là dung mụi thường được sử dụng tỏch chiết CKS từ hệ sợi rất cú hiệu quả. Metanol cũng loại bỏ những tạp chất phõn cực khụng mong muốn. Cỏc loại đường và peptit cú trong sinh khối cú thể tỏch bằng cỏc dung mụi khụng phõn cực hoặc rượu thấp là khụng thớch hợp như etanol, metanol, …[132,168,179]
1.5.2. Tỏch chiết CKS từ dịch lọc
Cỏc chất cú trọng lượng phõn tử thấp thường hũa tan trong nước và dung mụi hữu cơ. Để tỏch chiết cú hiệu quả, phải lựa chọn dung mụi hũa tan CKS như etyl-acetat, butanol, etanol…và cú thể bổ sung cỏc chất như: axit oleic, axit palmitic…để làm tăng khả năng hũa tan của CKS trong dung mụi hữu cơ. Dung mụi cú chứa CKS được cụ chõn khụng ở nhiệt độ thấp, thường dưới 60°C để loại dung mụi. CKS thụ nhận được bằng phương phỏp tỏch chiết từ sinh khối và dịch lọc là nguyờn liệu cơ sở để tinh chế.[31,103,171].
1.5.3. Tinh chế CKS
Kết tinh là phương phỏp cơ bản nhất để tinh chế CKS và tỏch chiết cỏc sản phẩm phõn tớch để xỏc định tớnh chất lý húa của chỳng. Sự kết tinh cú thể thực hiện bằng cỏch giảm nhiệt độ hay thay đổi dung mụi. Dung mụi chứa cỏc vệt khỏng sinh cuối cựng của quỏ trỡnh kết tinh cú thể loại bỏ bằng cỏch cụ chõn khụng. Phương phỏp sắc ký hấp phụ, sắc ký bản mỏng hoặc sắc ký lỏng cao ỏp là những phương phỏp thụng dụng để tinh chế và tỏch chiết CKS.
1.5.4. Đơn vị chất khỏng sinh
Hoạt tớnh sinh học của CKS thường được biểu hiện bằng đơn vị cú điều kiện trong 1ml dung dịch (đv/ml) hoặc trong 1mg (đv/mg) chế phẩm. Đơn vị hoạt tớnh của CKS là lượng khỏng sinh nhỏ nhất cú thể ức chế sinh trưởng hoặc tiờu diệt một chủng vi sinh vật kiểm định trong một thể tớch mụi trường nhất định.
Vớ dụ đơn vị hoạt tớnh của penixillin là lượng penixillin nhỏ nhất cú thể ức chế sự sinh trưởng của tụ cầu vàng 209P trong 50 ml mụi trường canh thang. Ngày nay, đối với cỏc chất đó tinh khiết, người ta xỏc định đơn vị theo định lượng (g/ml). Con số g/ml càng tiến dần đến 1000 càng chứng tỏ độ tinh khiết của
CKS. Trước đõy 1 mg penixillin tương đương 1667 đơn vị (Oxford), nhưng độ tinh khiết của streptomyxin rất cao, 1 mg streptomyxin tương đương 1000 đv [4].
1.5.5. Phương phỏp xỏc định cấu trỳc hoỏ học bằng quang phổ cộng hưởng từ hạt nhõn. từ hạt nhõn.
Quang phổ cộng hưởng từ hạt nhõn đựơc phỏt hiện vào đầu những năm 1960 và hiện nay được coi là một trong những kỹ thuật quan trọng nhất trong việc xỏc định cấu trỳc phõn tử. Sự cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR) là một trong những dạng quang phổ học rất phức tạp. Khi cỏc hạt nhõn được đặt trong một từ trường, phần lớn cỏc spin sắp xếp thẳng hàng theo phương của từ trường và nằm ở trạng thỏi spin thấp hơn. Bức xạ điện từ cú thể gõy nờn sự chuyển tiếp từ trạng thỏi spin thấp hơn lờn trạng thỏi spin cao hơn. Một phổ NMR là một đồ thị biểu diễn độ lớn và cỏc dạng năng lượng được hấp thụ bởi một phõn tử khi cỏc nguyờn tử của nú cú sự
chuyển tiếp từ trạng thỏi spin thấp hơn lờn trạng thỏi spin cao hơn trong từ trường đặt vào [9,28,131].
Sự cộng hưởng là một khỏi niệm đựơc dựng để mụ tả sự hấp thụ bức xạ điện từ khi tần số của sự tiến động và tần số của sự bức xạ điện từ kết hợp với nhau. Đú là lý do tại sao toàn bộ quỏ trỡnh này được gọi là sự cộng hưởng từ hạt nhõn. Sự hấp thụ năng lượng bởi một phõn tử được đo và được vẽ thành đồ thị để đưa ra quang phổ NMR.
Nhiều loại hạt nhõn nguyờn tử khỏc nhau trong phõn tử, như 13C hay 1H,
khụng hấp thụ năng lượng ở cựng tần số. Thực tế, thường cú cỏc mụi trường húa học khỏc nhau tồn tại trong 1 phõn tử, nú làm thay đổi cỏc tần số cộng hưởng của cỏc hạt nhõn khỏc nhau. Bằng cỏch quan sỏt cỏc tần số cộng hưởng khỏc nhau đo được trong kỹ thuật quang phổ NMR, thụng tin về cỏc mụi trường húa học khỏc nhau trong phõn tử được thu nhận và định hướng cho việc hiểu biết về cấu trỳc phõn tử.