CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. XẠ KHUẨN VÀ SỰ HèNH THÀNH KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN
1.3.4. Streptomyces và xạ khuẩn hiếm
Xạ khuẩn điển hỡnh được phõn chia thành 2 nhúm. Streptomyces và xạ khuẩn hiếm. Streptomyces là nhúm xạ khuẩn chiếm ưu thế trong đất, chi này cú khoảng
500 loài. Xạ khuẩn hiếm lại được chia thành hơn 50 chi khỏc nhau và gồm nhiều loài chưa cụng bố, chỳng thường sinh trưởng chậm, tạo thành khuẩn lạc nhỏ, thường khú bảo quản và nuụi cấy trong mụi trường dịch thể. Trong khi đú,
Streptomyces lại rất thuận tiện cho việc tỡm kiếm và sàng lọc chất khỏng
sinh.[60,108, 150].
B ảng 1.1. Cỏc loại typ thành tế bào khỏc nhau ở Actinomycetes Typ thành tế bào Meso- DAP LL- DAP
Glyxin Arabinoza Galactoza Chi đại diện
II + + ** Micromonospora, Actinoplane III + Actinomadura, Microbispora IV + + *** +*** Nocardia, Mycobacterium
DAP, diaminopimelic acid, Alanin và glutamic đều cú mặt ở +
* Glyxin là amino axit duy nhất khụng chứa carbon đối xứng trong phõn tử của chỳng. Do đú, glycin khụng cú cấu hỡnh dạng D hay L.
** Trong họ Micromonospora thỡ L-alanin tại vị trớ số 1 của phần peptit đổi thành glyxin ( tức là loại mất nhúm –CH3)
*** Trong nhúm xạ khuẩn cú chứa axit mycolic như Norcadia và
Mycobacterium, thỡ thành tế bào cú chứa arabinogalactan (cấu tạo bởi arabinoza
và galactoza)
Theo Lechevalier và Lechevalier, 1967, dựa vào 5000 chủng phõn lập từ 16 mẫu đất, đó chia ra khu hệ xạ khuẩn trong đất như sau: Chi Streptomyces chiếm
95,43%, chi Norcadia chiếm 1,98%, Micromonospora chiếm 1,4%,
Thermomonospora 0,22%, Actinoplanes 0,2%, Microbispora 0,18%,
Streptosporangium 0,1%, Actinomadura 0,1%.
Năm 1970, Lechevalier và Lechevalier đó đưa ra tiờu chuẩn phõn chia thành tế bào của xạ khuẩn điển hỡnh ra làm 4 typ. [91,92]. Vào những năm 1980, cấu trỳc húa học của peptydoglycan đó được làm sỏng tỏ và typ thành tế bào lại được xỏc nhận lại lần nữa.
1.3.4.1.Thành tế bào typ I
Cú chứa LL-DAP và glyxin. Đại diện của typ này là chi Streptomyces cú
khoảng 500 loài [108]. Streptomyces là chi lớn nhất. Hầu hết cỏc chủng thuộc chi
này đều sinh trưởng nhanh, tạo thành khuẩn ty khớ sinh và tạo bào tử. Chỳng sinh ra nhiều chất khỏng sinh. Trong chu trỡnh sống của xạ khuẩn, chỳng thể hiện sự biệt
húa về hỡnh dạng rất phức tạp, nhưng trong đất, chỳng thường tồn tại dưới dạng bào tử [77].
1.3.4.2.Thành tế bào typ II
Chứa meso-DAP, glycin và axit N-glycolyl muramic. Một số chủng thuộc họ này cú chứa 3’ OH-meso-DAP. Hầu hết cỏc chi này thuộc họ Micromonosporaceae. Họ này gồm cỏc đại diện: Micromonospora, Actinoplanes, Dactylosporangium,
Catenuloplanes (lysin thay thế DAP). Hầu hết cỏc chủng thuộc họ này đều khụng
tạo khuẩn ty khớ sinh. Một số chủng tạo thành nang bào tử và bào tử động [108].
Thành phần đường
Arabinoza Galactoza Xyloza Maduroza Họ
A + + _ _ Pseudonocardiaceae
B - - _ + Streptosporangiaceae
Thermomonosporaceae
C - - _ _ Nocardiopsaceae
D + - + _
1.3.4.3. Thành tế bào typ III
Chứa meso-DAP. Loại này gồm rất nhiều họ như Streptosporangiaceae, Thermomonosporaceae (thuộc nhúm Actinomadura), Nocadiopsaceae và Pseudonocardiaceae. Xạ khuẩn cú dạng meso-DAP và tạo thành khuẩn ty khớ sinh thường khụng dễ dàng xỏ định được. Họ này được phõn biệt với cỏc họ khỏc nhờ thành phần đường trong toàn bộ tế bào.
1.3.4.4.Thành tế bào typ IV.
Chứa meso-DAP, arabinoza và galactoza. Những vi khuẩn thuộc nhúm này
gồm: Mycobacterium, Nocardia, Gordonia và Rhodococcus. Chỳng đều cú axit
loài gõy bệnh phổi, ho gà...về hỡnh dạng thỡ thường hỡnh que hoặc đa hỡnh, cú dạng sợi đơn giản hoặc cú xu thế tạo thành cỏc mảnh nhỏ hỡnh que [108, 148].
1.3.4.5.Đặc điểm hỡnh thỏi của xạ khuẩn
Khuẩn lạc
Khỏc với cỏc vi sinh vật khỏc, khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xự xỡ, cú dạng da, dạng vụi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc cú ba lớp: lớp vỏ ngoài cú dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa cú cấu trỳc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp cú chức năng sinh học khỏc nhau. Cỏc sản phẩm trong quỏ trỡnh trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…cú thể được tớch luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong mụi trường lờn men. Khuẩn lạc xạ khuẩn cú màu sắc khỏc nhau: đỏ, da cam, vàng, nõu, xỏm, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh [7,8,176,181]. Cỏc loài xạ khuẩn cú thể tạo cỏc loại sắc hoà tố tan trong mụi trường nuụi cấy. Hướng sinh trưởng của khuẩn ty vào phớa trong hoặc ra ngoài mặt mụi trường tạo thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khớ sinh của khuẩn lạc xạ khuẩn. Khuẩn ty khớ sinh phỏt triển ra ngoài khụng khớ, thường phần cuối cỏc khuẩn ty này biến thành cuống sinh bào tử [114,134,154].
Khuẩn ty
Khuẩn ty của xạ khuẩn trụng giống hệ sợi của vi nấm, phõn nhỏnh và khụng cú vỏch ngăn. Xạ khuẩn phỏt triển theo kiểu mọc chồi, phõn nhỏnh, khoảng 30àm một nhỏnh. Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đoạn phỏt triển là 11àm [181], “nhõn” tế bào xạ khuẩn phỏt triển đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty. Do vậy, mỗi đoạn khuẩn ty hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lờn sau 1-2giờ xuất hiện quỏ trỡnh tổng hợp ADN, nhõn cỏc gen cần thiết từ genom và tiến hành tổng hợp protein. Cứ như vậy khuẩn ty hỡnh thành và phỏt triển.
Xạ khuẩn thuộc nhúm cơ thể dị dưỡng, thường sử dụng nguồn cacbon như đường, tinh bột, rượu, axit hữu cơ, polysacarit. Nguồn nitơ vụ cơ thường là nitrat, muối amon, nguồn nitơ hữu cơ là: pepton, protein, cao ngụ, cao nấm
men…Khả năng đồng húa cỏc chất ở cỏc loài xạ khuẩn khỏc nhau là khỏc nhau. Phần lớn chỳng ưa khớ, ưa ẩm, phỏt triển tốt ở mụi trường trung tớnh hoặc hơi kiềm.
Cấu trỳc tế bào
Xạ khuẩn thuộc nhúm vi khuẩn G(+). Thành tế bào xạ khuẩn gồm 3 lớp: lớp ngoài dày khoảng 60-120A°, khi già cú thể là 150A°; lớp giữa rắn và chắc hơn, dày khoảng 50A°, lớp trong dày 50A° được cấu tạo chủ yếu từ cỏc lớp glycopeptit gồm cỏc gốc N-axetylglucozamin (NAG) liờn kết với cỏc axit N-axetylmuramic (NAM) bởi cỏc liờn kết 1,4- glycozit. Khi xử lý bằng lizozym cỏc liờn kết này bị phỏ vỡ, thành tế bào bị phỏ hủy để lại màng nguyờn sinh chất bao bọc phần cũn lại của tế bào gọi là thể sinh chất (protoplast). Màng tế bào xạ khuẩn chứa nhiều enzym tham gia vào quỏ trỡnh trao đổi chất và quỏ trỡnh vận chuyển chất qua màng [42, 77, 108, 134, 150, 171, 182].
Màng sinh chất của xạ khuẩn chủ yếu bao gồm hai thành phần là photpholipit và protein. Một trong những đặc điểm đỏng lưu ý của xạ khuẩn là chỳng khụng bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự tỏi sắp xếp lại cỏc phần tử ADN. Điều này gõy ra một số hiện tượng lạ như: tạo ra tớnh đa hỡnh thỏi, tớnh khỏng thuốc. Hơn nữa, sự tự nhõn lờn của cỏc đoạn ADN cũn làm phức tạp thờm việc nghiờn cứu di truyền của xạ khuẩn.
Sự hỡnh thành bào tử của xạ khuẩn
Hỡnh thỏi, cuống sinh bào tử và bào tử là cỏc đặc điểm quan trọng nhất trong phõn loại xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn cú dạng thẳng hoặc lượn súng (RF), dạng xoắn lũ so (S), chuỗi bào tử khụng phỏt triển hoặc xoắn đơn giản, cú hỡnh múc cõu (RA). Bào tử hỡnh thành đồng thời trờn tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo hai cỏch: kết đoạn hay cắt khỳc và thường cú hỡnh trụ, ovan, cầu, que với mộp nhẵn hoặc xự xỡ, cú gai hoặc gai phỏt triển dài thành dạng lụng [114].
Muốn kớch thớch sự hỡnh thành bào tử trước hết phải kớch thớch sự sinh trưởng của khuẩn ty khớ sinh. Nếu mụi trường giầu dinh dưỡng quỏ thỡ quỏ trỡnh sinh bào
tử thường bị kỡm hóm [99]. Trong nhiều trường hợp khi kớch thớch sự hỡnh thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi.
1.3.5. Phương phỏp phõn loại xạ khuẩn
1.3.5.1. Thành tế bào (Peptidoglycan)
Vi khuẩn cú một thành tế bào riờng biệt, tại đú biểu hiện nhiều biến đổi thuận lợi cho cỏc tiờu chuẩn phõn loại. Peptiđoglycan được tỡm thấy ở tất cả cỏc vi khuẩn thật trừ Mycoplasma. Trong khi vi khuẩn Gram (-) cú lớp peptiđoglycan mỏng với cấu trỳc thụng thường thỡ vi khuẩn Gram (+) lại cú lớp này dầy với cấu trỳc biến đổi mang tớnh phõn loại. Cú hai typ cấu trỳc peptiđoglycan, typ A và typ B. Mặc dự rất khú xỏc định trực tiếp những biến đổi về mặt cấu trỳc nhưng cỏc dạng này thường được xỏc định thụng qua thành phần axit amin của peptiđoglycan tinh sạch [108]. Ngoài sự khỏc biệt phức tạp này thỡ sự biến đổi trong liờn kết chộo giữa điamino axit cũng hữu ớch cho việc phõn loại và xỏc định đặc điểm vi khuẩn. Vỡ thế việc phõn tớch peptiđoglycan được coi là một trong những tiờu chuẩn hoỏ phõn loại thiết yếu nhất cho vi khuẩn Gram(+), trong đú cú xạ khuẩn. Cỏc đồng phõn axit điaminopimelic (DAP) của peptiđoglycan, là một trong cỏc amino axit chỡa khoỏ phổ biến nhất, cú thể được xỏc định bằng một phương phỏp đơn giản: thuỷ phõn toàn bộ tế bào - tiếp đú dựng phộp sắc ký bản mỏng [20, 25, 67,83,127,128]. Nhiều vi khuẩn lactic và vi khuẩn coryneform chứa lysin hoặc ornithin dưới dạng cỏc axit amin chỡa khoỏ, chỳng cũng được tỡm thấy trong protein. Khi người ta khụng phỏt hiện được bất cứ đồng phõn DAP nào thỡ thành phần axit amin phải được xỏc định bằng cỏch thuỷ phõn peptiđoglycan đó tinh sạch nhờ mỏy phõn tớch axit amin tự động hoặc phương phỏp sắc ký lỏng cao ỏp (HPLC). Ngoài ra trong thành tế bào, thành phần đường và typ thành tế bào là những chỉ số hữu ớch nữa cho hoỏ phõn loại núi chung , đặc biệt đối với một số nhúm xạ khuẩn núi riờng [144,146, 161].
1.3.5.2.Axit bộo tế bào
lớn để xỏc định cỏc đặc điểm phõn loại. Chuẩn bị mẫu cho cỏc metyl este và phõn tớch sắc ký khớ khụng đặc biệt dành cho mục đớch phõn loại này . Người ta phõn cỏc axit bộo tế bào thành ba dạng chớnh [83]:
- Dạng mạch thẳng chứa cỏc axit C15 và C18 cựng với cỏc axit đơn khụng no tương ứng,
- Dạng mạch nhỏnh chủ yếu chứa cỏc axit iso và anteiso chiếm ưu thế nhưng thiếu cỏc axit khụng no. Tuy nhiờn cỏc axit mạch nhỏnh iso chứa cỏc axit khụng no tương ứng lại chiếm ưu thế ở dạng mạch nhỏnh của một số xạ khuẩn và vi khuẩn Gram (-)
- Dạng phức, dạng này chứa thành phần của cả hai dạng trờn và được tỡm thấy ở
một số vi khuẩn Gram (+), chủ yếu ở xạ khuẩn .
Cú một số sự biến đổi đặc biệt ở axit bộo khụng nằm ở màng tế bào chất. Vi khuẩn Gram (-) cú vỏ tế bào đặc trưng, màng ngoài chứa axit bộo 3-hyđroxy tiện lợi làm vai trũ đỏnh dấu ( marker) khi phõn loại. Axit mycolic là axit bộo 2-alkyl 3- hyđroxy phõn tử lượng cao.
1.3.5.3.Cỏc isoprenoit quinon
Cỏc isoprenoit quinon là chất tương tự coenzym Q của chuỗi hụ hấp và được tỡm thấy nhiều trong cỏc vi khuẩn hiếu khớ. Phần lớn cỏc vi kuẩn cú thành phần cỏc isoprenoit quinon đơn giản, trong khớ đú hầu hết cỏc xạ khuẩn lại cú thành phần này phức tạp và đụi khi lại cú cỏc đồng phõn cấu trỳc.
Menaquinon là quinon ưu thế ở vi khuẩn Gram (+) chứa cỏc isoprenoit quinon. Vi khuẩn sống trong cỏc mụi trường khắc nghiệt thường cú những quinon bất thường. Cỏc phõn tớch định tớnh isopren quinon cần dựng phộp sắc ký lỏng cao ỏp (HPLC) và đụi khi cũn cần cả khối phổ ký để xỏc định đặc điểm loài ở cấp độ phõn tử. Phộp sắc ký bản mỏng là một kỹ thuật cực kỳ đơn giản và hữu dụng để mụ tả định tớnh tớnh chất của một số lượng mẫu lớn.
Thành phần của ADN được trỡnh bày dưới dạng tỷ lệ G+C là một trong những thành phần thiết yếu của genom một vi sinh vật vỡ người ta đó biết tỉ số A/T bằng G/C. Tỷ lệ này ở vi khuẩn và nấm men biến đổi rất nhiều từ ớt hơn 30mol% đến hơn 70mol %.[63,64,74,159]. Đõy chớnh là những chỉ số rất giỏ trị dựng trong phõn loại xạ khuẩn. Phương phỏp biến tớnh bằng nhiệt được dựng phổ biến nhằm xỏc định thành phần bazơ này.[147]. Gần đõy một phương phỏp phõn tớch mới, dựng HPLC tiếp sau việc phõn hủy nhờ enzym, thành phần ADN ngày càng trở nờn một chỉ số phổ biến và thường xuyờn dựng để xỏc định đặc điểm xạ khuẩn. Phương phỏp HPLC cú một ưu điểm nữa là dung dịch ADN chứa ARN cú thể được đưa vào phõn tớch HPLC bằng cỏch tỏch hoàn toàn ARN trờn sắc đồ. Càng nhiều số liệu được thu thập thỡ độ tin cậy của tiờu chuẩn càng tăng.[81].
1.3.5.5. Lai ADN-ADN
Kỹ thuật lai ADN-ADN cú thể kiểm tra được cỏc đoạn tương đồng giữa hai vi sinh vật bằng cỏch so sỏnh tỉ lệ tỏi tổ hợp khỏc nguồn gốc của cỏc ADN mạch đơn. Vỡ kớch cỡ genom của vi khuẩn và nấm men là khụng quỏ lớn nờn kỹ thuật này được ỏp dụng dễ dàng ở cấp độ ADN nhiễm sắc thể. Mặc dầu cú nhiều phương phỏp thụng dụng để xỏc định mối quan hệ họ hàng của ADN, nhưng theo nhận định chung về vi khuẩn thỡ ranh giới giữa cỏc loài, sự tương đồng về ADN là khoảng 70%. Gần đõy Ezaki và cộng sự đưa ra kỹ thuật sử dụng chất nền huỳnh quang thay cho đồng vị phúng xạ. Kỹ thuật này làm cho việc sử dụng phộp lai ADN-ADN để xỏc định đặc điểm vi sinh vật một cỏch nhanh chúng. [59,108]
Phộp lai ADN-ADN là phương phỏp tốt nhất đưa ra một cặp kết quả cuối cựng khi xỏc định đặc điểm. Cần nhớ rằng tớnh tương đồng ADN-ADN khụng phải là một giỏ trị tuyệt đối như thành phần bazơ của ADN mà nú chỉ là chỉ số tương đụớ giữa cỏc bờn tham gia nờn nú khụng phự hợp cho việc mụ tả một taxon (đơn vị phõn loại) [20,22,23,80].
Hiện nay phần lớn cỏc nhà khoa học trờn thế giới đều cho rằng mức độ tương đồng về trỡnh tự ARNr phản ỏnh mối quan hệ tiến húa giữa cỏc cỏ thể vi sinh vật [74, 97, 170]. Tất cả cỏc loài vi sinh vật đều cú cựng một cỏch tổng hợp protein nhờ cỏc riboxom. Vỡ vậy người ta đó tiến hành so sỏnh trỡnh tự nucleotit của gen mó húa ARNr ở cỏc vi sinh vật khỏc nhau để xỏc định mối quan hệ tiến hoỏ giữa chỳng. ARNr là phõn tử lý tưởng cho cỏc nghiờn cứu về tiến hoỏ của vi sinh vật và mối quan hệ giữa chỳng bởi vỡ chỳng là thành phần cơ bản cú trong mọi tế bào vi sinh vật. [24,102]. Vai trũ và chức năng của chỳng là giống nhau ở tất cả cỏc riboxom. Người ta nhận thấy cấu trỳc khụng gian của phõn tử ARNr rất giống nhau giữa cỏc loài vi sinh vật khỏc nhau. Cỏc gen mó húa cho chỳng được bảo tồn rất tốt trong quỏ trỡnh tiến hoỏ. Trong quỏ trỡnh tiến hoỏ, cỏc vựng gen đú cú thể bị những đột biến nhất định, nhưng chọn lọc tự nhiờn chỉ giữ lại những đột biến trung tớnh, ớt làm thay đổi cấu trỳc khụng gian của ARNr, ớt ảnh hưởng đến sự tổng hợp protein của sinh vật. [158,159].
Dựa vào những vựng bảo thủ trong gen mó hoỏ cho phõn tử ARNr, cỏc nhà khoa học đó thiết kế cỏc cặp mồi vạn năng để cú thể khuếch đại cỏc vựng biến đổi. So sỏnh sự khỏc biệt giữa cỏc vựng này, người ta cú thể chỉ ra được những sự khỏc biệt giữa cỏc loài gần gũi [85]. Theo Robert W. Bauman, nếu hai loài vi khuẩn cú sự khỏc biệt về trỡnh tự gen ARNr 16S lớn hơn 3% thỡ cú thể xem là hai loài khỏc nhau [135].
Theo cỏc nhà khoa học thỡ dung lượng phỏt sinh loài của phõn tử ARNr 23S là lớn hơn so với phõn tử ARNr 16S. Tuy nhiờn trỡnh tự đó được xỏc định hồn chỉnh của gen ARNr 23S là rất ớt trong khi đú trỡnh tự của gen ARNr 16S là khỏ phong phỳ và được cụng bố rộng rói trờn ngõn hàng gen quốc tế. Chớnh vỡ vậy phương phỏp giải trỡnh tự gen mó hoỏ ARNr 16S để làm sỏng tỏ mối quan hệ phỏt sinh