CHƯƠNG 2 NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.6. Lờn men tạo khỏng sinh
2.2.6.1. Lựa chọn mụi trường lờn men thớch hợp [125]
Xạ khuẩn được lờn men trờn cỏc mụi trường cơ bản (theo Porter) là: A - 4, A - 4H, A - 9, A -12, ISP - 4 và Gauze I. Sau 96 giờ nuụi cấy lắc trũn 220 vũng/phỳt ở nhiệt độ phũng. Xỏc định hoạt tớnh khỏng sinh trong dịch lờn men (phương phỏp đục lỗ) và sinh khối (phương phỏp khoanh giấy lọc) để chọn ra mụi trường cơ bản phự hợp cho những nghiờn cứu tiếp theo.
2.2.6.2. Ảnh hưởng của cỏc nguồn cacbon, nitơ lờn sinh tổng hợp chất khỏng sinh
Xạ khuẩn được lờn men trờn mụi trường dịch thể trong bỡnh nún 250ml với thành phần mụi trường cơ bản như sau:
Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Bổ sung nguồn cacbon(%): Tinh bột tan 1 và 2; glucoza - 1,5; lactoza - 1,5; saccaroza - 1,5; rỉ đường - 1,5; vào hỗn hợp dung dịch muối (dung dịch muối A) đó bổ sung 0,2% (NH4)2SO4 .
Bổ sung giống và lờn men trờn mỏy lắc trũn với tốc độ 220 vũng/phỳt. Sau 96 giờ lờn men xỏc định hoạt tớnh khỏng sinh trong dịch lờn men bằng phương phỏp đục lỗ thạch.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Bổ sung nguồn nitơ (%): Cao nấm men - 1,0; bột đậu tương 1 và 2; pepton – 1; (NH4)2SO4 - 0,2 ; NH4Cl - 0,1 và KNO3 - 0,1 vào hỗn hợp dung dịch muối đó bổ sung thờm 1,5% glucoza. Sau đú bổ sung giống rồi lờn men và thử hoạt tớnh khỏng sinh bằng phương phỏp đục lỗ.
2.2.6.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng hỡnh thành chất khỏng sinh
Xạ khuẩn được nuụi lắc trờn mụi trường A-12 (220 vũng/phỳt ) đó chỉnh pH theo cỏc pH 5, 6, 7, 8, 9 bằng NaOH và HCl 1N. Sau 120 giờ thử hoạt tớnh khỏng sinh.
2.2.6.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng hỡnh thành chất khỏng sinh
Xạ khuẩn được nuụi cấy vào mụi trường A-12 và nuụi lắc 220 vũng/ phỳt ở
cỏc nhiệt độ 250C, 300C, 370C sau 120 giờ thử hoạt tớnh khỏng sinh bằng phương
phỏp đục lỗ.
2.2.6.5. Động học của quỏ trỡnh lờn men
Xạ khuẩn được lờn men trờn mụi trường dịch thể phự hợp trong bỡnh tam giỏc 250 ml chứa 100 ml mụi trường. Nuụi trờn mỏy lắc 220 vũng/phỳt. Sau 24 giờ lấy một bỡnh xỏc định cỏc thụng số: sinh khối, pH, hoạt tớnh khỏng sinh.
Mục đớch của việc nghiờn cứu động học lờn men là để xỏc định thời gian và điếu kiện tối ưu cho việc hỡnh thành CKS.
Hoạt tớnh khỏng sinh (đv/ml) được xỏc định theo phương phỏp của Dmitrieva [4]
2.2.6.6.Phương phỏp tối ưu húa của Box-Willson (phương phỏp tỡm giỏ trị tối ưu của hàm mục tiờu khi cỏc biến số thay đổi) [2]
- Chọn 3 biến của thành phõn mụi trường là glucoza, bột đậu tương và thể tớch
mụi trường.
- Mức trung bỡnh của 3 biến là: glucoza 10g/l, bột đậu tương 10g/l, thể tịch mụi trường là 75ml (dựa trờn thành phõn mụi trường đó chọn cho chủng TC- 54 là A-4)
- Thớ nghiệm lặp lại 3 lần
- Xỏc định hàm mục tiờu: trong cỏc chỉ tiờu đó chọn, chỉ tiờu nào là quan trọng
nhất, tiờu biểu nhất cho quỏ trỡnh tổng hợp CKS.
Pha 1,8lớt mụi trường cú nồng độ bột đậu tương – 7g/l, glucoza – 7g/l, NaCl 5g/l, CaCO3-1g/l chia vào 12 bỡnh nún dung tớch 500ml, mỗi bỡnh chứa 100 ml mụi trường và 12 bỡnh nún dung tớch 500 ml, mỗi bỡnh chứa 50ml mụi trường. Cõn bổ sung vào cỏc mụi trường lượng bột đậu tương và glucoza cụ thể như sau: - 3 bỡnh thớ nghiệm 1, mỗi bỡnh 0,6g bột đậu tương và 0,6g glucoza.
- 3 bỡnh thớ nghiệm 2 chỉ bổ sung 0,6g glucoza mỗi bỡnh. - 3 bỡnh ở thớ nghiệm 3, mỗi bỡnh bổ sung 0,6 g bột đậu tương - 3 bỡnh ở thớ nghiệm 4 khụng bổ sung.
- 3 bỡnh ở ths nghiệm 5, mỗi bỡnh 0,3g bột đậu tương và 0,3g glucoza. - 3 bỡnh ở thớ nghiệm 6, mỗi bỡnh 0,3g glucoza.
- 3 bỡnh ở thớ nghiệm 7, mỗi bỡnh 0,3g bột đậu tương. - 3 bỡnh ở thớ nghiệm 8, khụng bổ sung.
2.2.6.7. Lờn men trờn mụi trường xốp (rắn)[120]
Xạ khuẩn được nuụi trờn nhiều nguồn cơ chất khỏc nhau, sau 7 ngày bắt đầu kiểm tra hoạt tớnh khỏng sinh bằng cỏch cõn 1g mụi trường nuụi cấy cho vào đĩa Petri đó cấy vi sinh vật kiểm định (cỏc bước tiếp theo giống phương phỏp thỏi thạch).