CHƯƠNG 2 NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.8. Xỏc định một số tớnh chất của chất khỏng sinh
2.2.8.1. Xỏc định khả năng bền nhiệt của chất khỏng sinh
Dịch nuụi cấy sau khi lọc được đun cỏch thuỷ ở 400C, 700C và 1000C kộo dài
20, 40, 60 phỳt, sau đú làm nguội và xỏc định hoạt tớnh khỏng sinh bằng phương phỏp đục lỗ thạch. [7].
2.2.8.2. Xỏc định Rf của chất khỏng sinh bằng sắc ký giấy.
CKS được hoà tan trong cỏc dung mụi hữu cơ khỏc nhau rồi chấm 0,05 ml dịch hoà tan này lờn giấy sắc ký Whatman số 1 với kớch thước 2x20 cm, chạy trong cỏc hệ dung mụi khỏc nhau. Sau khi chạy sắc ký, băng giấy được làm khụ tự nhiờn
và hiện hỡnh bằng phương phỏp vi sinh vật với vi sinh vật kiểm định là Fusarium
oxysporum. Rf được tớnh theo cụng thức:
Rf = d / D
Trong đú: d - là khoảng cỏch từ điểm chấm tới điểm hiện CKS.
D - là khoảng cỏch từ điểm chấm đến điểm dung mụi chạy đến .
2.2.8.3. Xỏc định phổ tử ngoại, hồng ngoại của chất khỏng sinh
Sau khi cú CKS ở dạng tinh khiết, tiến hành đo phổ hấp phụ tử ngoại và hồng ngoại.
2.2.8.4. Phõn tớch nồng độ CKS bằng sắc ký lỏng cao ỏp ( HPLC)[103].
Nguyờn tắc: Phương phỏp này cho phộp xỏc định nhanh hàm lượng cỏc hợp
chất đi qua dưới tỏc dụng của UV với độ tỏch tốt, kết quả cho độ chớnh xỏc cao nhưng đũi hỏi mẫu và dung mụi phải thật sạch.
Tiến hành: Chất phản ứng chạy qua mỏy -680, hai bơm 510, vũi bơm U6k.
Bộ tỏch súng 410UV. Sử dụng cột RP18, kớch thước cột 125mm x 4,6mm, tốc độ chảy 0,8ml/phỳt. Bước súng 220nm.
Pha động: Dung dịch A 500ml Na2B4O7 (0,1M), dung dịch B 500ml KH2PO4 (0,1M).
Chuẩn bị mẫu: CKS thu được sau khi sắc ký trao đổi ion được sử dụng để bơm lờn cột.
2.2.8.5. Phõn tớch cấu trỳc chất khỏng sinh TC-54 bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR)[9]
Cấu trỳc hoỏ học của chất khỏng sinh được xỏc định trong phũng thớ nghiệm về dược phẩm của Trường Đại học Pari 5 (Laboratorie de Pharmacognosie, Faculte de Pharmacie, Pari 5).
Chất sau khi tinh sạch được đưa vào vựng từ trường Bo sẽ bị tỏch thành những proton cú cỏc mức năng lượng khỏc nhau từ thấp đến cao. Sự khỏc nhau này được phản ỏnh thụng qua tần số cộng hưởng. Tần số này được ghi lại dưới dạng cỏc phổ proton, carbon, … nhờ mỏy cụng hưởng từ hạt nhõn Bruker, Avance 400 (Đức). Dựa vào độ dịch chuyển của cỏc proton khi giải cỏc phổ trờn sẽ xỏc định được số nguyờn tử C, H cũng như nhũng nhúm chức cú thể tham gia vào bộ khung cacrbon.
CKS TC-54 sau khi đó được tinh sạch, giải hấp phụ trong etanol. Dịch etanol cho bay hơi trờn mày chõn khụng PeedVac, SPD 1010 (Mỹ). Phần cặn được hũa tan trở lại trong dung dịch dimethyl sulfoxode (DMSO) để tiến hành đo và phõn tớch cỏc phổ.
2.2.8.6. Xỏc định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) [8,112].
CKS được hũa tan trong nước hoặc cồn 70% đến nồng độ 10mg/ml. Sau đú pha loóng vào mụi trường nuụi cấy vi sinh vật kiểm định theo hệ số 2. 1:1/2:1/4:1/8:1/16:1/32:1/64.... Cấy VSV kiểm định vào 1ml mụi trường và nuuoi ở nhiệt độ thớch hợp. Đối chứng khụng bổ sung CKS. Sau 5 ngày xỏc định nồng độ ức chế tối thiểu.