Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Các phương pháp phân tích
2.4.10. Phương pháp thử hoạt tính gây độc và ức chế sự tăng sinh tế bào dòng Vero
bào dòng Vero
2.4.10.1. Nguyên tắc phương pháp ] [150]
Thử hoạt tính gây độc và ức chế sự tăng sinh tế bào dòng Vero (Tế bào thận khỉ xanh Châu Phi) được thực hiện theo phương pháp MTT [3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] [150]. MTT được Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ đánh giá là phương pháp quy chuẩn và hiệu quả cho sàng lọc nhanh các chất có hoạt tính gây độc hoặc ức chế sự tăng sinh tế bào.
Nguyên tắc của phương pháp là gián tiếp xác định hoạt tính của chất thử qua khả năng ức chế enzym oxidoreductase phụ thuộc NAD(P)H của tế bào. Enzym trong ty thể này xúc tác phản ứng khử thuốc nhuộm tetrazolium MTT màu vàng thành dạng formazan khơng hồ tan, có màu tím, qua đó có thể phản ánh tương quan số lượng các tế bào đang phát triển khi đo ở bước sóng λ = 540/720nm.
2.4.10.2. Cách thực hiện
Tế bào thận khỉ xanh Châu Phi dòng Vero được cung cấp bởi ATCC (American Type Culture Collection), Mỹ. Tế bào được nuôi cấy ở 37oC, CO2 5% trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung L-glutamine 2mM, kháng sinh (Penicillin + Streptomycin sulfate) và huyết thanh bê 5-10%. Dịch tế bào sau đó được nhỏ lên phiến vi lượng 96 giếng (1,5 x 105 tế bào/giếng), ủ với các mẫu thử ở dải nồng độ từ 100 6,25 µg/mL đối với mẫu cao chiết hoặc 50
1µg/mL đối với chất tinh sạch, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Ellipticine hoặc
Paclitaxel (Taxol) trong DMSO được dùng làm chất chuẩn dương tính (+). Sản phẩm chuyển hóa dạng tinh thể formazan được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich) và đo mật độ quang ở λ 540/720nm trên thiết bị Infinite F50 (Tecan, Männedorf, Thụy Sỹ).
Khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ở nồng độ nhất định của chất thử tính theo % so với đối chứng theo cơng thức (2.13):
CI (%) = [1-(ODmẫu/ODđối chứng (-))] x 100% (2.13) Trong đó:
CI (%) là tỷ lệ ức chế tế bào (cell inhibition) (%)
ODmẫu, ODđối chứng (-) là giá trị mật độ quang đo được của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng (-),
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (% ức chế ≥50%) được xác định giá trị IC50 (µg/mL hoặc µM) là nồng độ của mẫu thử mà tại đó ức chế 50% sự sống sót của tế bào, sử dụng phần mềm TableCurve AISN Sofware (Jandel Scientific, San Rafiel, CA).
2.4.11. Phương pháp kiểm tra vi sinh vật hiếu khí tổng số theo TCVN 4885:2005
2.4.11.1. Nguyên tắc
Sử dụng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở 30oC±1 trong 72 ± 3 giờ.
2.4.11.2. Xác định vi sinh vật hiếu khí tổng số:
- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy (Plate count agar, PCA) và dung dịch nước peptone, tiệt trùng ở 121oC/15 phút.
- Xử lý và pha loãng mẫu trong nước peptone vô khuẩn: nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, … - Cấy 1mL mẫu nguyên thủy, các nồng độ pha lỗng định cấy vào 15mL mơi trường PCA và ủ ở 30oC ±1/72 ± 3 giờ; Sau thời gian nuôi cấy, đếm tất cả các đĩa có số khuẩn lạc từ 15÷300 CFU.
- Kết quả: Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 15 ÷ 300 CFU của hai nồng độ pha loãng liên tiếp. Tổng số vi sinh vật hiếu khí có trong 1g hay 1mL sản phẩm (N, CFU/mL) được tính theo cơng thức (2.14):
𝑁 = ∑ 𝐶
𝑉 × (𝑛1+ 0,1 × 𝑛2) × 𝑑 (2.14)
Trong đó:
V: Thể tích mẫu cấy (mL)
C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa thạch
n1 , n2: Số đĩa ở hai nồng độ pha loãng liên tiếp đã chọn d: Hệ số pha loãng đã chọn thứ nhất