2.4.12.4. Xác định các nhóm chức đặc trưng và tương tác của các thành phần trong các hạt bằng thiết bị phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR) được sử dụng để xác định các nhóm chức đặc trưng có trong hỗn hợp các thành phần, trong đó mỗi nhóm chức dao động ở các tần số xác định trên phổ IR. Khi thay đổi, phối trộn các thành phần này, sự tương tác giữa các thành phần có thể xảy ra sự chuyển dịch của các pic hấp thụ của các nhóm chức.
Hình 2.14. Thiết bị quang phổ hồng ngoại Nicolet iS10
Hình 2.15. Thiết bị quang phổ hấp thụ tử ngoại- khả kiến UV-Vis
Các mẫu hạt CCG được ghi phổ hồng ngoại IR trên thiết bị phổ hồng ngoại Nicolet iS10 (Thermo Scientific, USA) tại Viện Kỹ thuật Nhiệt đới- Viện Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam (Hình 2.14) với phổ nền là khơng khí, qt phổ ở vùng 400cm-1 ÷ 4000 cm-1, độ phân giải 8 cm-1, số lần quét 32 lần. Căn cứ
vào các vị trí của các pic đặc trưng trên phổ IR để xác định các nhóm chức đặc trưng của vật liệu.
2.4.12.5. Phương pháp phổ hấp thụ tử ngoại- khả kiến
Phương pháp UV-Vis được sử dụng để xác định hàm lượng α-mangostin trong các dung dịch thử nghiệm; xác định hiệu suất tải α-mangostin của các tổ hợp hạt nano CCG; xây dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng α-mangostin giải phóng ra từ các tổ hợp hạt nano CCG theo thời gian thử nghiệm trong các môi trường pH khác nhau.
- Cơ sở của phương pháp:
Phổ tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet-Visible - UV - Vis) là phương pháp phân tích sử dụng định luật Lambert-Beer để thể hiện mối liên hệ giữa cường độ của ánh sáng đơn sắc trước và sau khi đi qua môi trường hấp thụ. Vùng bức xạ được sử dụng gồm vùng tử ngoại (UV) 200÷400 nm và vùng khả kiến (Vis) 400 ÷ 800 nm.
- Cách thực hiện:
Chuẩn bị dung dịch mẫu, pha loãng tới nồng độ cần thiết. Tiến hành đo độ hấp thụ trên thiết bị phổ UV-Vis Libra S80 (hãng Biochrom, Hoa Kỳ) tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới - Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam (Hình 2.15) ở dải bước sóng từ 220 đến 400nm [151]. Dựa vào phương trình đường chuẩn hiệu chỉnh hàm lượng α-mangostin để xác định nồng độ của α-mangostin trong các dung dịch mẫu thử.
2.4.12.6.Phương pháp xác định hiệu suất mang α-mangostin
- Cơ sở của phương pháp:
Hiệu suất mang α-mangostin được đánh giá gián tiếp thông qua hàm lượng α- mangostin bị sót lại trong dung mơi sau khi ly tâm tách hạt tổ hợp CCG bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại- khả kiến (UV-Vis).
- Cách thực hiện:
Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng α-mangostin trong dịch sau ly tâm tách hạt CCG:
Chuẩn bị dãy chuẩn: Cân 0,01g α-mangostin cho vào cốc chứa 100mL dung dịch sau ly tâm và khuấy từ liên tục với tốc độ 400 vịng/phút để hồ tan α- mangostin. Pha loãng dung dịch thành dãy chuẩn có nồng độ giảm dần.
Ghi phổ UV-Vis của dãy chuẩn trên thiết bị phổ UV-Vis Libra S80 (hãng Biochrom, Hoa Kỳ) tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ở dải bước sóng từ 200 đến 400nm. Từ dữ liệu phổ xác định bước sóng cực đại (λmax) và độ hấp thụ ánh sáng của α-mangostin trong dung dịch sau ly tâm ở bước sóng cực đại (λmax).
Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm excel để dựng đường chuẩn mô phỏng sự phụ thuộc mật độ quang và nồng độ của α-mangostin trong dung dịch thử nghiệm. Viết phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn có dạng y = ax + b và hệ số hồi quy tuyến tính (R2).
Xác định α-mangostin trong dịch sau ly tâm: Phần dịch tách ra sau ly tâm thu hạt CCG dạng ướt được định lượng và đo phổ UV-Vis. Dựa vào đường chuẩn xác định α-mangostin trong dịch sau ly tâm để tính hàm lượng α-mangostin cịn sót lại trong dịch này (m1).
Hiệu suất mang α-mangostin được tính theo cơng thức (2.16)
H =mo− m1
mo × 100 (2.16)
Trong đó:
H là hiệu suất mang α-mangostin (% khối lượng)
m1 là lượng α-mangostin sót lại trong dung mơi sau ly tâm (g) mo là lượng α-mangostin ban đầu dùng để tạo hạt tổ hợp CCG (g)
2.4.12.7. Thử nghiệm giải phóng α-mangostin từ tổ hợp CCG trong các mơi trường pH khác nhau
- Xây dựng đường chuẩn của α-mangostin trong ethanol tuyệt đối và các dung dịch có pH khác nhau:
Chuẩn bị các dung dịch đệm có pH khác nhau: phối trộn ethanol tuyệt đối với các dung dịch mô phỏng dịch vị ở các cơ quan tiêu hố điển hình trong cơ thể người theo tỷ lệ 1:1. Các dung dịch mô phỏng dịch vị bao gồm: Dung dịch pH 1,2: tương ứng với phần dưới dạ dày (nơi chất được lưu lại từ 1 đến 3 giờ); dung dịch pH 4,5: tương ứng với phần trên của dạ dày (nơi chất được lưu lại từ 30 đến 60 phút), tương ứng với ruột non (nơi chất ở lại từ 1 đến 5 giờ) và ruột già (nơi chất ở lại 10 giờ); dung dịch pH 6,8: tương ứng với vùng đại tràng trong cơ thể (nơi chất được lưu lại từ 10 đến 15 giờ) và dung dịch pH 7,4: tương ứng với vùng tá tràng trong cơ thể (nơi chất được lưu lại từ 30 đến 60 phút)
Chuẩn bị dãy chuẩn: Cân 0,01g α-mangostin cho vào cốc chứa 200mL dung dịch đệm và khuấy từ liên tục trong 8 giờ với tốc độ 400 vịng/phút. Sau 8 giờ, lọc bỏ phần khơng tan và pha lỗng thành dãy chuẩn có nồng độ giảm dần.
Ghi phổ UV-Vis của dãy chuẩn trên thiết bị phổ UV-Vis Libra S80 (hãng Biochrom, Hoa Kỳ) tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ở dải bước sóng từ 220 đến 400nm. Từ dữ liệu phổ xác định bước sóng cực đại (λmax) và độ hấp thụ ánh sáng của α-mangostin trong các dung dịch
ethanol 99,7% và các dung dịch pH 1,2, pH 4,5, pH 6,8, pH 7,4 có chứa 50% ethanol ở λmax.
Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm excel để dựng đường chuẩn mô phỏng sự phụ thuộc mật độ quang và nồng độ của α-mangostin trong các dung dịch thử nghiệm. Viết phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn y = ax + b và hệ số hồi quy tuyến tính (R2).
- Xác định hàm lượng α-mangostin từ các hạt tổ hợp CCG:
Để nghiên cứu q trình giải phóng α-mangostin từ các hạt tổ hợp: cân 0,01g hạt tổ hợp CCG cho vào cốc 250mL có chứa 200mL dung dịch đệm có pH khác nhau. Đặt cốc lên máy khuấy từ và khuấy với tốc độ 400 vòng/phút ở 37oC trong suốt thời gian theo dõi. Trong một giờ đầu, cứ 20 phút một lần và các giờ tiếp theo thì cứ sau 1 giờ, hút chính xác 5mL dịch trong và bổ sung thêm 5mL dung dịch đệm. Sau đó đo mật độ quang dịch mẫu đã lấy trên thiết bị UV-Vis ở bước sóng cực đại. Lượng α-mangostin giải phóng được tính tốn dựa trên phương trình đường chuẩn và giá trị mật độ quang đo được.
Phần trăm α-mangostin giải phóng được tính theo cơng thức: % α-mangostin giải phóng= Ct
C0×100 (%) (2.17) Trong đó:
C0 và Ct tương ứng là lượng α-mangostin có trong hạt CCG ban đầu và lượng α-mangostin giải phóng tại thời gian t.
- Xây dựng phương trình động học giải phóng α-mangostin từ các hạt tổ hợp trong các dung dịch đệm có pH khác nhau:
Có nhiều mơ hình động học liên quan đến q trình giải phóng hoạt chất được mang bởi các polyme hoặc hỗn hợp polyme. Cơ chế giải phóng hoạt chất khơng chỉ phụ thuộc vào liều lượng hoạt chất, pH của mơi trường mà cịn phụ thuộc vào bản chất của hoạt chất và polyme. Các mơ hình động học giải phóng hoạt chất được áp dụng phổ biến nhất là:
(1) Phương trình mơ hình động học bậc khơng: 𝑥𝑡 = xo + k1× t (2.18)
(2) Phương trình mơ hình động học bậc 1:
log xt = log 𝑥o− k2× t/2,303 (2.19)
(3) Phương trình mơ hình động học Hixon- Crowell:
𝑥01⁄3− 𝑥𝑡1⁄3 = 𝑘3× 𝑡 (2.20)
(5) Phương trình định luận năng lượng ((hay phương trình Korsmeyer -
Peppas): xt
x∞ = k5× tn (2.22) Trong đó:
t: Thời gian giải phóng chất
xt và x0: là lượng chất (α-mangostin) giải phóng ở thời điểm t và thời điểm ban đầu. k1, k2, k3, k4, k5: hằng số phương trình
xt
x∞: là phần chất giải phóng vào mơi trường hịa tan
n: là hằng số khuếch tán, đặc trưng cho cơ chế giải phóng hoạt chất theo mơ hình Kosmeyer – Peppas. Khi n ≤ 0,5, sự giải phóng thuốc tuân theo định luật khuếch tán Fick. Khi n > 0,5, sự giải phóng thuốc là bất qui tắc (không tuân theo định luật khuếch tán Fick). Khi n = 1, giải phóng thuốc khơng tn theo định luật Fick mà tuân theo động học bậc một hoặc động học bậc không.
Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị mơ phỏng q trình giải phóng α- mangostin trong các dung dịch có pH khác nhau.
2.4.13. Đánh giá màu của giò bằng hệ thống Computer vision
Hình ảnh, màu sắc của sản phẩm được xác định thơng qua thị giác máy tính và xử lý hình ảnh bằng cách sử dụng hệ thống đo màu và xử lý ảnh (Computer Vision).
Các mẫu giò được đo màu bằng hệ thống thiết bị Computer Vision tại Viện Cơ Điện nông nghiệp và Cơng nghệ sau thu hoạch. Hệ thống thiết bị có sử dụng máy ảnh Canon EOS 450d, hệ thống đo và điều khiển cường độ ánh sáng kết hợp với đèn led có nhiệt độ màu 5500k, cường độ ánh sáng 1500lux. Từ thông số màu R, G, B trung bình của nhiều điểm ảnh tính ra các chỉ số màu L, a, b.
Trong đó, khoảng biến thiên màu theo các giá trị L, a, b:
- L phản ánh độ đậm nhạt (hay độ sáng), L có giá trị biến đổi từ 0 (tương ứng màu đen) tới 100 (tương ứng màu trắng).
- a biến đổi từ -60 (tương ứng màu xanh lục) tới 60 (tương ứng màu đỏ) - b biến đổi từ -60 (tương ứng màu xanh lam) tới 60 (tương ứng màu vàng)
2.4.14. Đánh giá màu của rượu bằng phương pháp đo quang
Xác định màu sắc của sản phẩm bằng phương pháp đo quang dựa trên hiện tượng phản xạ của ánh sáng. Những nguồn sáng được truyền tới là ánh sáng trắng của các tia sáng đơn sắc (từ đỏ đến tím) có bước sóng khác nhau được chiếu lên vật liệu cần đo. Khi đó, tia sáng được phản xạ lại mắt người có màu sắc phản ánh màu sắc của vật liệu cần đo.
Các mẫu rượu được xác định màu bằng thiết bị quang phổ UV-Vis Libra S80 (Biochrom, Hoa Kỳ) tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với dải bước sóng từ 200 ÷ 700nm.
Chỉ số cường độ màu (I) và trạng thái màu (chỉ số Hue, H) được tính theo cơng thức (2.23) và (2.24) [152]:
I = OD420 + OD520+OD620 (2.23)
H = OD420 /OD520 (2.24)
Giá trị H phản ánh sự phát triển màu của rượu theo độ tuổi, phát triển thiên hướng màu cam. H thường <1 đối với rượu trẻ (0,5 ÷ 0,7) và >1 khi già hơn (tối đa 1,2÷1,3) (Phát triển theo hướng màu cam).
Tỷ lệ giữa các màu được đánh giá theo công thức 2.25, 2.26 và 2.27 [152]: Tỷ lệ màu vàng (Y, %): 𝑌 =𝑂𝐷420 𝐼 × 100 (2.25) Tỷ lệ màu đỏ (R, %): 𝑅 =𝑂𝐷520 𝐼 × 100 (2.26) Tỷ lệ màu xanh (B, %): 𝐵 =𝑂𝐷620 𝐼 × 100 (2.27)
Trong đó OD420, OD520 và OD620 là giá trị mật độ quang của mẫu rượu đo trên thiết bị quang phổ UV-Vis tại bước sóng 420, 520 và 620nm.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu phân tích thành phần hố học của vỏ quả măng cụt
Kết quả đánh giá một số thành phần hoá học của vỏ quả măng cụt khô thu hoạch ở 06 tỉnh trồng măng cụt phổ biến tại Việt Nam (Bao gồm: Cần Thơ, Vĩnh Long (An Bình), Trà Vinh (Cầu Kè), Bến Tre (Cái Mơn), Bình Dương (Lái Thiêu) và Lâm Đồng (Bảo Lộc)) được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả phân tích một số thành phần hố học của vỏ quả măng cụt khơ thu hoạch tại các tỉnh khác nhau ở Việt Nam
TT Hàm lượng Vĩnh Long (An Bình) Bình Dương (Lái Thiêu) Trà Vinh (Cầu Kè) Cần Thơ (Thành phố Cần Thơ) Bến Tre (Cái Mơn) Lâm Đồng (Bảo Lộc) 1 Nước (%) 8,94±0,35 8,65±0,43 9,43±0,09 7,85±0,21 5,70±0,95 9,33 ±0,47 2 Polyphenol tổng số (g GAE/100g) 20,12 ± 0,46 20,45 ± 0,56 23,34 ± 0,52 21,91 ± 0,04 19,29±0,05 20,28±0,10 3 Tanin (Polyphenol) (%) 13,80 ± 0,23 14,15 ± 0,11 14,50 ± 0,45 13,91 ± 0,44 11,54±2,01 14,15±0,09 4 Anthocyanin g C-3-G/100g) 0,12±0,00 0,13±0,01 0,16±0,01 0,11± 0,00 0,12±0,01 0,13±0,00 6 Cellulose (%) 41,91 ± 0,28 43,44 ± 0,53 43,34 ± 0,43 41,56 ± 0,41 41,57± 1,27 42,12±1,46 7 Tinh bột (%) 9,23 ± 0,57 8,43 ± 0,50 8,40 ± 0,30 8,86 ± 0,14 - 8,43 ± 0,50 8 Pectin (%) 2,52 ± 0,69 3,07 ± 0,86 2,82 ± 0,63 2,79 ± 0,75 - 3,08 ± 0,22 9 Tro (%) 3,68 ± 0,12 3,27 ± 0,09 3,87 ± 0,14 2,63 ± 0,10 - 3,36 ± 0,11 Số mẫu n=3; “-” không đánh giá;
Polyohenol tổng số (g GAE/100g): Định lượng polyphenol theo TCVN 9745-1:2013 Tanin (polyphenol) (%): Định lượng tanin (polyphenol) theo phương pháp Lowenthal
Kết quả phân tích cho thấy trong vỏ quả măng cụt khô thu hoạch vụ 2018 ở các tỉnh miền nam Việt Nam có hàm lượng polyphenol (được định lượng theo TCVN 9745-1:2013) dao động trong khoảng 19,29 ÷23,34% và tanin (polyphenol) (định lượng bằng phương pháp Lowenthal) từ 11,54÷14,50 (%), kết quả này cũng tương đương với nghiên cứu của Khanitha Moosophin (2010) (Hàm lượng tanin 11,14%) [6] và không thua kém so với một số nguyên liệu truyền thống đang được
sử dụng để khai thác các hợp chất polyphenol, tanin như chè (polyphenol 13,3÷26,1%, catechin 9,63÷21,54%) [153], ổi (233,76 mg GAE/g chất khô) [29]. Kết quả phân tích cho thấy vỏ quả măng cụt thu thập tại các địa phương này là nguồn khai thác tiềm năng các hợp chất polyphenol.
Tuy nhiên, đánh giá các thông tin về thực trạng sản xuất và tiêu thụ măng cụt, sự tác động của biến đổi khí hậu và chính sách phát triển loại cây này tại 06 địa phương cho thấy ở 2 Lâm Đồng và Cần Thơ ngày càng tăng cả về diện tích trồng, sản lượng, chất lượng quả trong đó đặc biệt măng cụt Bảo Lộc – Lâm Đồng ngày càng khẳng định được thương hiệu trên thị trường [19, 21]. Vì vậy, với mục tiêu khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học nhóm polyphenol từ vỏ quả măng cụt, chúng tơi đã lựa chọn măng cụt Lâm Đồng và Cần Thơ để nghiên cứu.
Ngoài các hợp chất polyphenol, hàm lượng hợp chất anthocyanin trong vỏ quả măng cụt tươi với hàm lượng tới 4235 ± 203,5g/kg quả tươi [96], không thua kém so với một số nguyên liệu giàu anthocyanin như khoai lang tím (687,58 ppm) [154] và quả việt quất tươi (7,2 ± 0,5 mg/g chất khô) [155]. Tuy nhiên, các mẫu vỏ quả măng cụt khô mà đề tài sử dụng hàm lượng mono anthocyanin thấp hơn đáng kể, hàm lượng dao động giữa các mẫu từ 0,11÷0,16 (g C-3-G/100g), chứng tỏ việc làm khơ nguyên liệu đã tác động tới sự tồn tại của nhóm hợp chất này. Điều này dự báo hàm lượng các hợp chất anthocyanin trong chiết xuất thu được từ vỏ quả măng cụt khô sẽ không nhiều.
Các hợp chất sơ cấp như cellulose, pectin, tinh bột trong các mẫu vỏ quả măng cụt khô chiếm tỷ phần khá lớn, với hơn 40% cellulose, 8% tinh bột và gần 3% pectin (so với khối lượng nguyên liệu khô). Kết quả nghiên cứu của Winuprasith và cộng sự (2013) hay của Mai và cộng sự (2015) cũng chỉ ra cellulose, pectin, protein, … là các hợp chất sơ cấp chủ yếu trong vỏ quả măng cụt [31, 32]. Các hợp chất này tham gia cấu trúc tạo nên thành tế bào thực vật, bao học và giữ các hoạt chất bên trong tế bào, chúng là những rào cản tự nhiên đối với q trình trích ly các hoạt chất từ vỏ quả măng cụt. Ngồi ra, hiện tượng gel hố của pectin sẽ khiến cho độ nhớt của hỗn hợp tăng gây cản trở sự tiếp cận của dung môi và hoạt chất, đồng thời cản trở quá trình lọc trong. Để phá vỡ rào cản tự nhiên của các hợp chất sơ cấp như cellulose, pectin, protein, v.v…, tạo điều kiện cho sự xâm nhập của dung mơi và giải phóng các hoạt chất, gần đây nhiều nghiên cứu đã ứng dụng các kỹ thuật hỗ trợ q trình trích ly như siêu âm, vi sóng hay sử dụng các loại enzym khác nhau để thuỷ phân các hợp chất này, v.v... Các kỹ thuật hỗ trợ này đã nâng cao hiệu suất thu các hoạt chất, giảm thời gian khai thác và bảo tồn được hoạt tính của các chiết xuất [52], [59-65], [69, 70]. Từ những phân tích này chúng tơi đã lựa chọn kỹ thuật siêu âm và sử dụng chế phẩm enzym Pectinex® Ultra SP-L (với hỗn hợp 3 loại enzym:
pectinase, hemicellulose và beta-glucanase) để xử lý nguyên liệu trước khi khai thác