Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Các phương pháp phân tích
2.4.12. Các phương pháp nghiên cứu đặc trưng của hạt nano tổ hợp carrageeenan-
carrageeenan-chitosan-α-mangostin (CCG)
2.4.12.1. Khảo sát hình thái, cấu trúc vật liệu bằng kính hiển vi điện tử qt
Hình thái, cấu trúc của vật liệu được quan sát và ghi ảnh trên thiết bị hiển vi điện tử quét trường phát xạ (FESEM S-4800, Hitachi, Nhật Bản) trong môi trường khí trơ tại Viện Khoa học vật liệu- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Trước khi tiến hành, mẫu được phủ một lớp platin mỏng để khơng bị tích điện trên bề mặt mẫu. Thiết bị chụp ảnh ghi nhận bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt vật liệu với độ khuếch đại nhiều lần (1000 ÷ 200000 lần) dưới hệ thống kính hiển vi điện tử sẽ giúp cho việc quan sát cấu trúc và hình thái biến đổi của các thành phần trong vật liệu.
2.4.12.2. Xác định phân bố kích thước hạt bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động
- Cơ sở của phương pháp: Các hạt lơ lửng trong một chất lỏng liên tục chuyển động ngẫu nhiên (chuyển động Brown) và kích thước của các hạt trực tiếp ảnh hưởng đến tốc độ của chúng. Hạt nhỏ di chuyển nhanh hơn so với những hạt có kích thước lớn hơn. Trong phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamics Light Scattering- DLS), ánh sáng laser đơn sắc đi qua mẫu và ánh sáng tán xạ được phát hiện và ghi nhận ở một góc độ nhất định. Sự phụ thuộc vào thời gian của cường độ tán xạ cho thấy các hạt đang chuyển động nhanh như thế nào. Từ thơng tin này, có thể tính tốn kích thước trung bình cũng như sự phân bố kích thước của hạt.
- Cách xác định kích thước hạt: Lấy một
lượng nhất định hạt (CS, CAR và CCG) và phân tán hạt trong nước (nồng độ mẫu khơng vượt q 40% khối lượng, dung tích đo 100μL) và xác định kích thước cũng như sự phân bố kích thước hạt trên thiết bị Zetasizer SZ-100Z2 của hãng HORIBA- Pháp tại Viện Kỹ thuật Nhiệt đới- Viện Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam (Hình 2.12).
Hình 2.12. Thiết bị phân tích kích thước hạt Zetasizer SZ-100Z2
Thiết bị dùng một hệ quang học gồm 1 nguồn sáng laser rắn bán dẫn có bước sóng 532nm và cơng suất 10mW, dải đo kích thước 0,2nm ÷ 100 μm, dải đo thế zeta từ -500mV đến +500mV.
Kích thước hạt được xác định dựa vào phương trình mơ hình hố mối liên hệ giữa kích thước hạt với hệ số phân tán (Phương trình Stokes Einstein):
𝑅ℎ = 𝑘𝐵𝑇
6𝜋ƞ𝐷𝑡 (2.15)
Trong đó:
Rh- Bán kính thủy động học của hạt (m)
Dt- Hệ số khuếch tán tịnh tiến (hệ số phân tán của hạt trong dung dịch) (m2/s) kB- Hằng số Boltzmann (J/K)
T- Nhiệt độ tuyệt đối (K)
η- Độ nhớt của dung dịch (N*s/m2)
Xử lý số liệu trên phần mềm HORIBA để đưa ra thơng tin về kích thước trung bình, phân bố kích thước hạt.
2.4.12.3. Đánh giá đặc tính kỵ nước/ưa nước của hạt nano tổ hợp carrageeenan-chitosan-α-mangostin (CCG)
- Nguyên tắc của phương pháp:
Khả năng thấm ướt là khả năng loang ra của một chất lỏng trên bề mặt rắn. Nước được đổ lên bề mặt vật liệu thấm ướt sẽ trải ra thành một lớp mỏng, khi trên bề mặt khơng thấm ướt thì nước tụ lại thành giọt. Góc tạo ra giữa bề mặt giọt nước và bề mặt vật liệu (góc tiếp xúc) cho biết khả năng thấm ướt của vật liệu. Khi đo được góc tiếp xúc, người ta sẽ xác định được khả năng thấm ướt của chất lỏng lên bề mặt vật liệu. Giá trị góc tiếp xúc lớn cho thấy vật liệu có khả năng thấm ướt kém và ngược lại các vật liệu có khả năng thấm ướt tốt có góc tiếp xúc nhỏ.
Cách thực hiện:
Đặc tính kỵ nước/ưa nước của các hạt CCG được đánh giá thơng qua góc tiếp xúc bằng máy đo Phoenix-150, SEO- Hàn Quốc (Viện Vậy lý ứng dụng và Thiết bị khoa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam) (Hình 2.13) bằng cách đo góc tạo bởi giọt nước và bề mặt của viên nén được ép từ các hạt CCG.
Hình 2.13. Thiết bị đo góc tiếp xúc Phoenix-150
2.4.12.4. Xác định các nhóm chức đặc trưng và tương tác của các thành phần trong các hạt bằng thiết bị phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR) được sử dụng để xác định các nhóm chức đặc trưng có trong hỗn hợp các thành phần, trong đó mỗi nhóm chức dao động ở các tần số xác định trên phổ IR. Khi thay đổi, phối trộn các thành phần này, sự tương tác giữa các thành phần có thể xảy ra sự chuyển dịch của các pic hấp thụ của các nhóm chức.
Hình 2.14. Thiết bị quang phổ hồng ngoại Nicolet iS10
Hình 2.15. Thiết bị quang phổ hấp thụ tử ngoại- khả kiến UV-Vis
Các mẫu hạt CCG được ghi phổ hồng ngoại IR trên thiết bị phổ hồng ngoại Nicolet iS10 (Thermo Scientific, USA) tại Viện Kỹ thuật Nhiệt đới- Viện Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam (Hình 2.14) với phổ nền là khơng khí, qt phổ ở vùng 400cm-1 ÷ 4000 cm-1, độ phân giải 8 cm-1, số lần quét 32 lần. Căn cứ
vào các vị trí của các pic đặc trưng trên phổ IR để xác định các nhóm chức đặc trưng của vật liệu.
2.4.12.5. Phương pháp phổ hấp thụ tử ngoại- khả kiến
Phương pháp UV-Vis được sử dụng để xác định hàm lượng α-mangostin trong các dung dịch thử nghiệm; xác định hiệu suất tải α-mangostin của các tổ hợp hạt nano CCG; xây dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng α-mangostin giải phóng ra từ các tổ hợp hạt nano CCG theo thời gian thử nghiệm trong các môi trường pH khác nhau.
- Cơ sở của phương pháp:
Phổ tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet-Visible - UV - Vis) là phương pháp phân tích sử dụng định luật Lambert-Beer để thể hiện mối liên hệ giữa cường độ của ánh sáng đơn sắc trước và sau khi đi qua môi trường hấp thụ. Vùng bức xạ được sử dụng gồm vùng tử ngoại (UV) 200÷400 nm và vùng khả kiến (Vis) 400 ÷ 800 nm.
- Cách thực hiện:
Chuẩn bị dung dịch mẫu, pha loãng tới nồng độ cần thiết. Tiến hành đo độ hấp thụ trên thiết bị phổ UV-Vis Libra S80 (hãng Biochrom, Hoa Kỳ) tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới - Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam (Hình 2.15) ở dải bước sóng từ 220 đến 400nm [151]. Dựa vào phương trình đường chuẩn hiệu chỉnh hàm lượng α-mangostin để xác định nồng độ của α-mangostin trong các dung dịch mẫu thử.
2.4.12.6.Phương pháp xác định hiệu suất mang α-mangostin
- Cơ sở của phương pháp:
Hiệu suất mang α-mangostin được đánh giá gián tiếp thông qua hàm lượng α- mangostin bị sót lại trong dung môi sau khi ly tâm tách hạt tổ hợp CCG bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại- khả kiến (UV-Vis).
- Cách thực hiện:
Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng α-mangostin trong dịch sau ly tâm tách hạt CCG:
Chuẩn bị dãy chuẩn: Cân 0,01g α-mangostin cho vào cốc chứa 100mL dung dịch sau ly tâm và khuấy từ liên tục với tốc độ 400 vịng/phút để hồ tan α- mangostin. Pha lỗng dung dịch thành dãy chuẩn có nồng độ giảm dần.
Ghi phổ UV-Vis của dãy chuẩn trên thiết bị phổ UV-Vis Libra S80 (hãng Biochrom, Hoa Kỳ) tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ở dải bước sóng từ 200 đến 400nm. Từ dữ liệu phổ xác định bước sóng cực đại (λmax) và độ hấp thụ ánh sáng của α-mangostin trong dung dịch sau ly tâm ở bước sóng cực đại (λmax).
Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm excel để dựng đường chuẩn mô phỏng sự phụ thuộc mật độ quang và nồng độ của α-mangostin trong dung dịch thử nghiệm. Viết phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn có dạng y = ax + b và hệ số hồi quy tuyến tính (R2).
Xác định α-mangostin trong dịch sau ly tâm: Phần dịch tách ra sau ly tâm thu hạt CCG dạng ướt được định lượng và đo phổ UV-Vis. Dựa vào đường chuẩn xác định α-mangostin trong dịch sau ly tâm để tính hàm lượng α-mangostin cịn sót lại trong dịch này (m1).
Hiệu suất mang α-mangostin được tính theo cơng thức (2.16)
H =mo− m1
mo × 100 (2.16)
Trong đó:
H là hiệu suất mang α-mangostin (% khối lượng)
m1 là lượng α-mangostin sót lại trong dung mơi sau ly tâm (g) mo là lượng α-mangostin ban đầu dùng để tạo hạt tổ hợp CCG (g)
2.4.12.7. Thử nghiệm giải phóng α-mangostin từ tổ hợp CCG trong các mơi trường pH khác nhau
- Xây dựng đường chuẩn của α-mangostin trong ethanol tuyệt đối và các dung dịch có pH khác nhau:
Chuẩn bị các dung dịch đệm có pH khác nhau: phối trộn ethanol tuyệt đối với các dung dịch mô phỏng dịch vị ở các cơ quan tiêu hố điển hình trong cơ thể người theo tỷ lệ 1:1. Các dung dịch mô phỏng dịch vị bao gồm: Dung dịch pH 1,2: tương ứng với phần dưới dạ dày (nơi chất được lưu lại từ 1 đến 3 giờ); dung dịch pH 4,5: tương ứng với phần trên của dạ dày (nơi chất được lưu lại từ 30 đến 60 phút), tương ứng với ruột non (nơi chất ở lại từ 1 đến 5 giờ) và ruột già (nơi chất ở lại 10 giờ); dung dịch pH 6,8: tương ứng với vùng đại tràng trong cơ thể (nơi chất được lưu lại từ 10 đến 15 giờ) và dung dịch pH 7,4: tương ứng với vùng tá tràng trong cơ thể (nơi chất được lưu lại từ 30 đến 60 phút)
Chuẩn bị dãy chuẩn: Cân 0,01g α-mangostin cho vào cốc chứa 200mL dung dịch đệm và khuấy từ liên tục trong 8 giờ với tốc độ 400 vòng/phút. Sau 8 giờ, lọc bỏ phần không tan và pha lỗng thành dãy chuẩn có nồng độ giảm dần.
Ghi phổ UV-Vis của dãy chuẩn trên thiết bị phổ UV-Vis Libra S80 (hãng Biochrom, Hoa Kỳ) tại Viện Kỹ thuật nhiệt đới - Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam ở dải bước sóng từ 220 đến 400nm. Từ dữ liệu phổ xác định bước sóng cực đại (λmax) và độ hấp thụ ánh sáng của α-mangostin trong các dung dịch
ethanol 99,7% và các dung dịch pH 1,2, pH 4,5, pH 6,8, pH 7,4 có chứa 50% ethanol ở λmax.
Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm excel để dựng đường chuẩn mô phỏng sự phụ thuộc mật độ quang và nồng độ của α-mangostin trong các dung dịch thử nghiệm. Viết phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn y = ax + b và hệ số hồi quy tuyến tính (R2).
- Xác định hàm lượng α-mangostin từ các hạt tổ hợp CCG:
Để nghiên cứu q trình giải phóng α-mangostin từ các hạt tổ hợp: cân 0,01g hạt tổ hợp CCG cho vào cốc 250mL có chứa 200mL dung dịch đệm có pH khác nhau. Đặt cốc lên máy khuấy từ và khuấy với tốc độ 400 vòng/phút ở 37oC trong suốt thời gian theo dõi. Trong một giờ đầu, cứ 20 phút một lần và các giờ tiếp theo thì cứ sau 1 giờ, hút chính xác 5mL dịch trong và bổ sung thêm 5mL dung dịch đệm. Sau đó đo mật độ quang dịch mẫu đã lấy trên thiết bị UV-Vis ở bước sóng cực đại. Lượng α-mangostin giải phóng được tính tốn dựa trên phương trình đường chuẩn và giá trị mật độ quang đo được.
Phần trăm α-mangostin giải phóng được tính theo cơng thức: % α-mangostin giải phóng= Ct
C0×100 (%) (2.17) Trong đó:
C0 và Ct tương ứng là lượng α-mangostin có trong hạt CCG ban đầu và lượng α-mangostin giải phóng tại thời gian t.
- Xây dựng phương trình động học giải phóng α-mangostin từ các hạt tổ hợp trong các dung dịch đệm có pH khác nhau:
Có nhiều mơ hình động học liên quan đến q trình giải phóng hoạt chất được mang bởi các polyme hoặc hỗn hợp polyme. Cơ chế giải phóng hoạt chất khơng chỉ phụ thuộc vào liều lượng hoạt chất, pH của mơi trường mà cịn phụ thuộc vào bản chất của hoạt chất và polyme. Các mơ hình động học giải phóng hoạt chất được áp dụng phổ biến nhất là:
(1) Phương trình mơ hình động học bậc khơng: 𝑥𝑡 = xo + k1× t (2.18)
(2) Phương trình mơ hình động học bậc 1:
log xt = log 𝑥o− k2× t/2,303 (2.19)
(3) Phương trình mơ hình động học Hixon- Crowell:
𝑥01⁄3− 𝑥𝑡1⁄3 = 𝑘3× 𝑡 (2.20)
(5) Phương trình định luận năng lượng ((hay phương trình Korsmeyer -
Peppas): xt
x∞ = k5× tn (2.22) Trong đó:
t: Thời gian giải phóng chất
xt và x0: là lượng chất (α-mangostin) giải phóng ở thời điểm t và thời điểm ban đầu. k1, k2, k3, k4, k5: hằng số phương trình
xt
x∞: là phần chất giải phóng vào mơi trường hịa tan
n: là hằng số khuếch tán, đặc trưng cho cơ chế giải phóng hoạt chất theo mơ hình Kosmeyer – Peppas. Khi n ≤ 0,5, sự giải phóng thuốc tuân theo định luật khuếch tán Fick. Khi n > 0,5, sự giải phóng thuốc là bất qui tắc (không tuân theo định luật khuếch tán Fick). Khi n = 1, giải phóng thuốc không tuân theo định luật Fick mà tuân theo động học bậc một hoặc động học bậc không.
Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị mơ phỏng q trình giải phóng α- mangostin trong các dung dịch có pH khác nhau.