Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Phương pháp phân lập một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ quả măng
phương pháp trích ly thơng thường, …, phương pháp trích ly bằng dung mơi có hỗ trợ của kỹ thuật siêu âm hay xử lý nguyên liệu bằng enzym đã được khảo sát trong đề tài này nhằm lựa chọn được phương pháp thu nhận các hợp chất có hoạt tính thuộc nhóm polyphenol (tanin, α-mangostin, …) của vỏ quả măng cụt đạt hiệu suất cao và bảo tồn được hoạt tính tốt nhất.
1.3. Phương pháp phân lập một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ quả măng cụt từ vỏ quả măng cụt
Phân lập là tách riêng một chất dưới dạng tinh khiết ra khỏi một hỗn hợp. Sau khi trích ly thu được dịch chiết thường là một hỗn hợp gồm các hoạt chất và một số chất khác. Để tách riêng hoạt chất hoặc trong nghiên cứu muốn tách riêng các chất để xác định cấu trúc, làm chất chuẩn, nghiên cứu dược lý, … người ta cần phải tiến hành phân lập từng chất dưới dạng tinh khiết.
Có nhiều phương pháp được sử dụng để phân lập các chất từ một hỗn hợp, như các phương pháp kết tinh phân đoạn, chưng cất phân đoạn, các kỹ thuật sắc ký, …[46].
1.3.1. Kết tinh phân đoạn
Phương pháp này dựa vào độ hòa tan khác nhau của từng chất khi hòa tan hỗn hợp vào một hoặc một hỗn hợp các dung mơi. Trong q trình để yên, dung môi bốc hơi từ từ, thành phần khó tan nhất sẽ kết tủa hoặc kết tinh trước. Lọc lấy phần phần tinh thể thô và kết tinh lại sẽ thu được chất tinh khiết. Phần dung dịch cịn lại có thể bay hơi dung mơi và kết tinh để tách các chất khác. Có thể kết hợp việc bay hơi dung môi với giảm nhiệt độ để quá trình kết tinh hiệu quả hơn. Dung mơi dùng để hóa tan/kết tinh phân đoạn thường là một dung mơi nhưng cũng có thể là một hỗn hợp 2 hoặc 3 dung môi trong trường hợp các chất khó kết tinh. Đối với một số nhóm chất đặc biệt, để phân lập người ta tạo ra các dẫn chất ít tan ví dụ tạo muối picrat alkaloid, tạo osazon các đường để các chất dễ kết tinh hơn.
1.3.2. Tách phân đoạn
Đối với một vài nhóm chất, người ta có thể tách riêng từng phân đoạn khỏi hỗn hợp dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của các chất thành phần như độ hòa tan trong các dung mơi, tính acid hay base và độ mạnh của tính acid hay base.
Các hệ dung mơi n-hexan-nước, ethyl acetate nước, … thường được sử dụng để tách phân đoạn các hợp chất xanthon trong dịch trích ly từ vỏ quả măng cụt, các xanthon thu được ở phân đoạn n-hexan, ethylacetate [74], tanin thu được ở phân đoạn acetone [27], …
Sắc ký điều chế là phương pháp phổ biến được sử dụng rất nhiều và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các chất tự nhiên. Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký.
Thành phần của các dịch chiết thực vật thường rất phức tạp và chứa nhiều chất khác nhau. Tính chất của các chất cần tách cũng rất thay đổi, từ các chất không hay rất kém phân cực tới các chất phân cực mạnh, từ các chất phân tử nhỏ tới các đại phân tử. Hàm lượng các chất trong hỗn hợp cũng rất thay đổi từ vài % tới %o hay thậm chí thấp hơn. Trong những trường hợp như vậy, các phương pháp phân lập cổ điển như kết tinh phân đoạn, chưng cất phân đoạn, … khơng thể đáp ứng được. Khi đó, kỹ thuật sắc ký như sắc ký cột, sắc kỹ lớp mỏng điều chế, sắc ký lỏng áp suất trung bình hoặc sắc ký lỏng cao áp điều chế và sắc ký phân bố ngược dòng sẽ là các kỹ thuật đươc lựa chọn sử dụng.
1.3.3.1. Sắc ký cột
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion... Chất hấp phụ được nhồi vào cột (phổ biến nhất là cột thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết và khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng phân tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu trọng lực không đủ lớn sẽ gây hiện tượng tắc cột (dung mơi khơng chảy được), khi đó ta phải sử dụng áp suất (áp suất trung bình - MPC, hoặc áp suất cao - HPLC).
Các nghiên cứu đã công bố cho thấy để phân lập các hợp chất nhóm xanthon thường sử dụng sắc ký cột với silica gel 60 (70 ÷ 230 mesh), gartanin, 1,3,8- trihydroxy-2-(3-methyl-2-butenyl)-4-(3-hydroxy-3-methylbutanoyl)-xanthone, rubraxanthone, 1,3,6,7-tetrahydroxy-8-prenylxanthone, garcinone C, xanthone I (9- hydroxycalabaxanthone) và mangostanaxanthone VIII thu được khi qua cột sắc ký silica gel (SiO2) với hệ dung mơi n-hexan : EtOAc có độ phân cực thay đổi từ tăng dần [75], các hợp chất tanin thu được khi chạy cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi acetone và nước [28], …
1.3.3.2 Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở các vị trí khác nhau.
Chất hấp phụ thường được sử dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel tráng trên đế nhơm hay đế thủy tinh. Trong q trình hấp phụ, sẽ xảy ra sự tranh giành giữa dung môi và chất tan để chiếm chỗ trên bề mặt chất hấp phụ và khi đạt được cân bằng, mỗi chất tan sẽ ở một vị trí khác nhau trên bản mỏng.
Nghiên cứu của Sakai và cộng sự (1993), sử dụng sắc ký lớp mỏng với silica gel 60 F254 trong xác định garcinone E, γ-mangostin [76]
Dịch trích ly vỏ quả măng cụt bao gồm dung mơi và hỗn hợp nhiều hợp chất khác nhau, các hợp chất mà đề tài định hướng thu nhận là polyphenol nói chung, xanthon, tanin, anthocyanin, … là những hợp chất ít bay hơi, có khả năng hồ tan trong dung mơi khác nhau. Vì vậy để làm giàu các hợp chất chúng tôi lựa chọn thực hiện phương pháp tách phân đoạn dựa vào khả năng hoà tan của các cấu tử trong các dung môi khác nhau là khác nhau, sau đó phân lập các chất bằng phương pháp sắc ký cột với các hệ dung môi khác nhau.