Trong nghiên cứu này chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm khác nhau về tần số siêu âm với khoảng khảo sát 13÷40kHz và giữ nguyên điều kiện nhiệt độ và thời gian siêu âm (60oC trong 30 phút), kết quả thể hiện trên Hình 3.9.
Quan sát kết quả trình bày ở Hình 3.9 cho thấy, trong dải tần số siêu âm khảo sát, sự tăng giảm tần số siêu âm và hiệu suất trích ly polyphenol tổng số tỷ lệ thuận với nhau. Hiệu suất trích ly polyphenol từ bột vỏ quả măng cụt khi trích ly có sự hỗ trợ của sóng siêu âm với tần số siêu âm cực đại 40kHz đạt giá trị cao nhất (64,08%). Hiện tượng tương tự với nghiên cứu của Suryono Suryono và cộng sự (2019) (hàm lượng xanthon thu được khi siêu âm ở tần số siêu âm 40kHz cao hơn 35kHz [169]. Sự tăng hiệu suất trích ly được lý giải là do khi tần số siêu âm tăng tạo ra nhiều bong bóng bọt và tới tần số đủ lớn sẽ khiến các bong bóng này bị phá vỡ hình thành lực tác động lớn tới bề mặt của vật liệu, gây tổn thương tế bào mơ thực vật, từ đó dung mơi có khả năng xâm nhập sâu hơn và hoà tan các hoạt chất, làm cho lượng hoạt chất tăng nhanh trong dung môi chiết [58, 59]. Từ kết quả nghiên cứu này chùng tôi chọn tần số siêu âm 40kHz để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm
Phân tích tác động của nhiệt độ tới hiệu suất trích ly polyphenol tổng số thể hiện trên Hình 3.10 cho thấy: trong khoảng nhiệt độ khảo sát từ 30oC đến 60oC, hiệu suất trích ly polyphenol tổng số tăng tỷ lệ thuận với sự tăng của nhiệt độ. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Suryono Suryono và cộng sự [169]. Hiện tượng này được giải thích do khi nhiệt độ tăng làm giảm độ nhớt của dung dịch, làm cho các phần tử trong hỗn hợp chuyển động nhanh hơn, sự xâm thực
50 60 70 80 90 100 40 27 13 H iệu suất t rí ch ly (% ) Tần số siêu âm (kHz)
chất tan từ nội bào ra ngồi mơi trường dễ dàng hơn và vì vậy hiệu suất trích ly tanin (polyphenol) tăng lên. Tuy nhiên sự gia tăng nhiệt độ quá mức sẽ ảnh hưởng tới độ bền cấu trúc cũng như hoạt tính của các hoạt chất. Nghiên cứu của Dam Sao Mai và cộng sự (2013) chỉ ra anthocyanin khi xử lý với nhiệt độ cao quá 60oC sẽ dễ dạng bị phân huỷ [48] vì vậy nhiệt độ 60oC đã được lựa chọn để xử lý siêu âm nguyên liệu vỏ quả măng cụt cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.10. Ảnh hưởng của tần số siêu âm
3.2.3.3. Ảnh hưởng của thời gian xử lý siêu âm
Hình 3.11. Ảnh hưởng của tần số siêu âm
Xem xét mối liên hệ giữa thời gian siêu âm và hiệu suất trích ly (kết quả nghiên thể hiện trên Hình 3.11cho thấy khi tăng thời gian siêu âm từ 10 phút lên 15 phút, hiệu suất trích ly tanin tăng lên, đạt mức cao nhất với thời gian trích ly 15 phút (đạt 77,62%). Sự gia tăng nhiệt độ và thời gian siêu âm đã làm tăng khả năng thâm nhập của dung mơi và q trình hịa tan hoạt chất vào dung môi diễn ra nhanh hơn [52]. Q trình xâm thực của dung mơi vào bên trong lớp vật liệu, sự hoà tan của hoạt chất vào dung môi đều cần thời gian để thực hiện, thời gian ngắn khơng đủ để hồ tan hoàn toàn hoạt chất, thời gian quá dài dẫn tới sự lãng phí và tăng nguy cơ chất tan tương tác với nhau, với các yếu tố có thể dẫn tới sự biến đổi chất. Thực
50 60 70 80 90 100 10 15 20 25 H iệu suất t rí ch ly (% )
Thời gian siêu âm (Phút)
(c) 50 60 70 80 90 100 30 40 50 60 H iệu suất t rí ch ly (% )
nghiệm trên vỏ quả măng cụt cho thấy khi tiếp tục tăng thời gian siêu âm để xử lý ngun liệu thì khơng những hiệu suất trích ly khơng tăng mà cịn có xu hướng giảm. Trong chiết xuất xanthon bằng kỹ thuật siêu âm, thời gian siêu âm không nên vượt quá 30 phút [169]. Vì vậy, thời gian siêu âm 15 phút là đủ để tác động sóng siêu âm với cường độ cực đại (40kHz), ở 60oC vào nguyên liệu vỏ quả măng cụt, làm tăng hiệu suất trích ly các hợp chất tanin và polyphenol. Với chế độ siêu âm này, sử dụng dung mơi ethanol 45% sẽ đạt được hiệu suất trích ly polyphenol tổng số cao nhất (77,62 ± 2,35%).
Từ việc khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thu nhận các hoạt chất từ vỏ quả măng cụt bằng phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của siêu âm chúng tôi đã xác định được các thông số công nghệ xử lý siêu âm như sau: Tần số siêu âm 40kHz, nhiệt độ siêu âm 60oC trong thời gian 15 phút.
3.2.4. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ quả măng cụt Việt Nam
Từ các khảo sát độc về 3 phương pháp trích ly trên đã lựa chọn được các điều kiện phù hợp nhất để thực hiện trích ly các hợp chất polyphenol từ vỏ quả măng cụt theo mỗi phương pháp. Để đánh giá lựa chọn một phương pháp để thực hiện cho các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm đánh giá so sánh hiệu quả thu nhận các hoạt chất của 3 phương pháp với nhau bằng cách thực hiện 3 thí nghiệm với điều kiện thực hiện cụ thể:
- Mẫu 1 (Ký hiệu mẫu: SE): Khơng xử lý ngun liệu, thực hiện trích ly theo điều kiện đã lựa chọn của phương pháp SE (dung môi ethanol 60%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20, nhiệt độ 60oC trong 120 phút)
- Mẫu 2 (Ký hiệu mẫu: ESE): xử lý nguyên liệu theo chế độ đã lựa chọn của phương pháp EAE (với 0,5 (ml/100g nguyên liệu) chế phẩm enzym Pectinex Ultra SP- L, ở 60oC tronng 30 phút) sau đó trích ly ở điều kiện đã lựa chọn của phương pháp SE (dung môi ethanol 60%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20, nhiệt độ 60oC trong 120 phút)
- Mẫu 3 (Ký hiệu mẫu: UAE): xử lý nguyên liệu theo chế độ đã lựa chọn của phương pháp UAE (siêu âm ở tần số 40kHz, ở 60oC trong 15 phút) sau đó trích ly ở điều kiện đã lựa chọn của phương pháp SE (dung môi ethanol 60%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20, nhiệt độ 60oC trong 120 phút)
Trình tự thực hiện thí nghiệm được mô tả ở mục 2.4.2.4. Kết quả thể hiện trên Bảng 3.2. Từ kết quả nghiên cứu này cho thấy về hiệu suất trích ly polyphenol tổng số của các mẫu có xử lý nguyên liệu bằng enzym hoặc bằng siêu âm đều cao hơn so với mẫu khơng xử lý ngun liệu, trong đó phương pháp trích ly có hỗ trợ của enzym tăng 5,76%, phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm tăng 4,52%).
Bảng 3.2. Đánh giá hiệu suất trích ly polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hố IC50 của các dịch trích ly thu được từ các phương pháp trích ly khác nhau
Ký hiệu mẫu SE EAE UAE
Hiệu suất trích ly polyphenol tổng số (%)
87,35 ±1,43 93,11±0,65 91,87±2,93
IC50 (µg/mL) 78,37 92,22 59,84
Trích ly có hỗ trợ của enzym với dung mơi ethanol 60% ở thí nghiệm này cho hiệu suất trích ly polyphenol tổng sổ cao hơn 13,78% so với khi sử dụng dung mơi ethanol 45% (theo kết quả trình bày ở mục 3.2.2). Hiện tượng tương tự cũng xẩy ra với phương pháp trích ly có hỗ trợ của siêu âm, khi sử dụng dung môi ethanol 60% hiệu suất trích ly polyphenol tổng số cao hơn 14,25%. Kết quả này một lần nữa chứng minh dung môi ethanol 60% là dung mơi hiệu quả trong trích ly các hợp chất polyphenol từ vỏ quả măng cụt và sự lựa chọn ethanol 60% làm dung mơi trích ly ở mục 3.2.1 đáng tin cậy. Ethanol 60%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 cũng được Zhang và cộng sự (2015) lựa chọn để nghiên cứu khai thác các hợp chất xanthon từ măng cụt [60].
Đánh giá hoạt tính chống oxy hố của các dịch trích ly thơng qua khả năng bẫy các gốc tự do DPPH (IC50) cho thấy: dịch trích ly thu được bằng phương pháp hỗ trợ siêu âm có hoạt tính chống oxy hố mạnh hơn so với dịch trích ly bằng phương pháp xử dụng xúc tác enzym. Điều đó cho thấy ngồi tác động lên nguyên liệu các enzym này cũng phần nào đã ảnh hưởng tới các hoạt chất, làm cho hoạt tính chống oxy hoá của chúng bị sụt giảm.
Như vậy, khi sử dụng kỹ thuật siêu âm và xúc tác enzym để xử lý nguyên liệu trước khi trích ly đều có tác dụng làm tăng hiệu suất thu nhận các hoạt chất polyphenol tổng số, hiệu suất trích ly polyphenol tổng số đều lớn hơn 90%. Dịch trích ly thu được đều thể hiện hoạt tính chống oxy hố mạnh, trong đó phương pháp trích ly siêu âm bảo tồn được hoạt tính chống oxy hố tốt hơn các phương pháp khác (IC50 dịch chiết thơ đạt 59,84(µg/mL)). Vì vậy, phương pháp trích ly siêu âm ở 40kHz, tại 60oC trong 15 phút với dung môi ethanol 60% đã được lựa chọn để khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học từ vỏ quả măng cụt trong các nghiên cứu tiếp theo.
Quy trình trích ly các hoạt chất nhóm polyphenol từ bột vỏ quả măng cụt khô được đề xuất như trong Hình 3.12. Theo quy trình này, bột vỏ quả măng cụt sau khi được phối trộn với dung môi ethanol 60% đã được gia nhiệt tới nhiệt độ 60oC theo tỷ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20 sẽ được thực hiện siêu âm với tần số 40 kHz ở nhiệt độ 60oC trong 15 phút. Kết thúc quá trình siêu âm hỗn hợp này được ủ duy trì
ở 60oC trong 120 phút để thực hiện q trình trích ly, sau đó tiến hành lọc hút chân khơng để thu dịch trích ly (Dịch chiết thơ).