CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
2.2.1.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (0,25 mm, Merck), RP-18 F254s (0,25 mm, Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sĩng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch sulfuric acid 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nĩng từ từ đến khi hiện màu.
2.2.1.2. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel cĩ cỡ hạt là 0,040 – 0,063 mm (230 - 400 mesh), pha đảo sử dụng loại RP-18 (30 - 50 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.); Diaion HP-20 (Misubishi Chemical Indutries Co., Ltd.).
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc
Cấu trúc hĩa học của các hợp chất được xác định trên cơ sở sử dụng các phép xác định thơng số vật lý và các phương pháp đo phở bằng các thiết bị hiện đại đồng
thời kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo. Các phương pháp đo được sử dụng gồm cĩ:
2.2.2.1. Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS)
Phở khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy FT-ICR-Mass spectrometry tại Viện Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam và máy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS tại Viện Hĩa sinh biển và trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc.
2.2.2.2. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR)
Phở NMR được đo trên máy đo trên máy Bruker DRX 500 MHz (Chất chuẩn nội là TMS) tại Viện Hố học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Các kỹ thuật phở cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
- Phở cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT. - Phở cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và NOESY. Dung mơi được sử dụng bao gồm các dung mơi DMSO, CD3OD. Việc lựa chọn dung mơi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo nguyên tắc dung mơi phải hịa tan hồn tồn mẫu thử.
2.2.2.3. Phổ lưỡng sắc trịn (CD)
Phở CD được đo trên máy ChirascanTM CD spectrometer (Applied Photophysics Ltd., Surrey, UK) tại Viện Hĩa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.2.2.4. Phương pháp tính tốn phổ CD lý thuyết
Tìm kiếm cấu dạng được thực hiện trên chương trình Spartan 14. Các cấu dạng cĩ thể cĩ sẽ được tối ưu hĩa và tính tốn lý thuyết dựa trên chương Gaussian 09. Phở CD theo tính tốn lý thuyết sẽ được thiết lập sau khi hiệu chỉnh dựa trên hệ số phân bố Boltzmann của các cấu dạng bền sử dụng phần mềm SpecDisv1.64.
2.2.2.5. Độ quay cực ([α]D)
Độ quay cực được đo trên máy JASCO P-2000 polarimeter của Viện Hĩa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học
2.2.3.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro Nguyên tắc Nguyên tắc
Hoạt tính kháng viêm được đánh giá qua tác dụng ức chế của các hợp chất đối với sự sản sinh NO trên tế bào BV2 được kích thích với LPS.
Nitric oxide (NO) là một phân tử quan trọng tham gia vào nhiều quá trình bệnh lý và sinh lý của cơ thể. Quá trình sản sinh NO là một trong các phản ứng tự bảo vệ của cơ thể tuy nhiên sự sản sinh quá mức lượng NO lại là nguyên nhân dẫn đến sự tởn thương của các tế bào và mơ, thúc đẩy quá trình viêm. Mức độ sản sinh NO cĩ thể phản ánh mức độ gây viêm và được coi là một trong những yếu tố chỉ thị cho quá trình viêm xảy ra. Các hợp chất ức chế sự sản sinh NO cĩ thể được coi là các tác nhân chống viêm [104].
BV2 là một dịng tế bào ở hệ thần kinh trung ương, được kích hoạt khi bị kích thích, sau đĩ giải phĩng iNOS và cuối cùng sản sinh NO. Sự ức chế sản xuất NO trong các tế bào BV2 được kích thích bởi LPS được coi là một phương pháp điều trị hiệu quả cho tình trạng viêm trong hệ thần kinh trung ương. Do đĩ, tế bào BV2 được sử dụng như một cơng cụ sàng lọc khi tìm kiếm các tác nhân kháng viêm trong những sản phẩm thiên nhiên [118].
Hoạt tính kháng viêm được tiến hành sau khi kiểm tra độc tính đối với tế bào bằng phương pháp so màu MTT. Nồng độ NO trong mơi trường thực nghiệm được xác định thơng qua phản ứng Griess [118].
Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro
Hoạt tính kháng viêm in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Yonsei, Hàn Quốc.
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro thơng qua ức chế sản sinh NO trên tế bào BV2 gồm 4 bước:
Bước 1: Nuơi cấy tế bào [118].
Tế bào BV2 được nuơi cấy trong mơi trường DMEM – F12 cĩ bở sung 10% huyết thanh (FBS), penicillin 100 IU/mL và streptomycin 100 g/mL ở điều kiện
37oC, 5% CO2.
Bước 2: Kiểm tra độc tính của các chất thử đối với tế bào BV2 theo phương
Mỗi giếng của đĩa 96 giếng chứa 100 L tế bào BV2 (3.105 tế bào) mơi trường DMEM – F12 10% FBS, được nuơi cấy ở 37oC, 5% CO2 trong 1 ngày. Sau đĩ, mơi trường ban đầu được thay thế bằng 100 L mơi trường chứa mẫu thử, thí nghiệm
được lặp ít nhất 3 lần. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng khơng cĩ mẫu thử, chỉ cĩ dung mơi pha mẫu để làm mẫu trắng. Tất cả được ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 48 giờ. Tiếp theo, 10 L MTT 2 mg/mL, hịa tan trong nước muối phosphate (PBS),
được thêm vào mỗi giếng. Sau 4 giờ, loại bỏ mơi trường, tinh thể formaran được hịa tan bằng 50 µl dimethylsulfoxide (DMSO). Các đĩa sau đĩ được đo mật độ quang (OD) ở bước sĩng 540 nm bằng máy quang phở. DMSO 10% được sử dụng như đối chứng âm [118].
- Phần trăm tế bào sống sĩt sẽ được tính theo cơng thức: %sống sĩt =ODmẫu thử− ODmẫu trắng
ODDMSO− ODmẫu trắng × 100
Bước 3: Đánh giá khả năng ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2.
Các tế bào BV2 nuơi cấy trong mơi trường DMEM – F12 10% FBS được đưa vào 96 giếng, 100 L tế bào (3.105 tế bào)/giếng, ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ. Loại bỏ mơi trường nuơi cấy thay bằng mơi trường DMEM – F12 1% FBS. Tế bào sau đĩ được ủ mẫu thử ở các nồng độ khác nhau trong 2 giờ, rồi được kích thích
bằng 0,5 g/mL LPS trong 24 giờ để sản sinh yếu tố NO. Một số giếng khơng được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng trắng. Đối chứng dương được sử dụng là L-NMMA.
Sự hiện diện của nitrit, là sản phẩm oxi hĩa của NO, được xác định bằng thuốc thử Griess (1% sulfanilamide, 0,1% naphtylethylenediamine dihydrochloride trong axit phosphoric 2%). Cụ thể là, 100 μL dịch nuơi cấy tế bào được trộn với 100 μL chất thử Griess trong 96 giếng, ủ ở nhiệt độ phịng trong 15 phút, sau đĩ hàm lượng nitrit sẽ được đo bằng máy đọc ELISA ở bước sĩng 525 nm. Mơi trường chứa 0,5 g LPS làm chất đối chứng âm [118]. Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS).
Phần trăm ức chế sự sản sinh NO của mẫu được tính theo cơng thức:
%ức chế = Hàm lượng Nitrit (mẫu thử) − Hàm lượng Nitrit (đối chứng trắng)
Hàm lượng Nitrit (đối chứng âm) − Hàm lượng Nitrit (đối chứng trắng)× 100
Các thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất phân lập được đến sự sản sinh NO trên tế bào BV2 kích thích bởi LPS được thực hiện ít nhất 3 lần và lấy giá trị trung bình. Phân tích số liệu, xây dựng đồ thị và tính tốn giá trị IC50 (theo phương pháp hồi qui Sigmoidal dose-response) được thực hiện trên phần mềm GraphPad Prism 6.0.
2.2.3.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng virus in vitro
Nguyên tắc: Xét nghiệm về hoạt tính kháng virus được thực hiện với phương
pháp SRB [119]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tởng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamin B (SRB). Giá trị OD của máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn trên phân tử protein, do đĩ lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.
Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng virus in vitro
Các hợp chất phân lập được từ lồi V. limonifolia và V. trifolia được đánh giá hoạt tính kháng virus in vitro với các virus coxsackievirus B3, enterovirus 71 và human rhinovirus B3. Các thí nghiệm này được thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Yonsei, Hàn Quốc. Quá trình tiến hành gồm các bước cụ thể như sau:
Virus coxsackievirus B3 (được cung cấp từ Trung tâm kiểm sốt và phịng chống dịch bệnh Hàn Quốc, Chungcheongbuk, Hàn Quốc); virus EV71 (được cung cấp từ Phịng nghiên cứu vắc xin phịng chống dịch bệnh Trung tâm Hàn Quốc, Cheongwon, Hàn Quốc) được nhân giống ở 37°C trong tế bào Vero (Manassas, VA, USA), là các tế bào biểu mơ thận cĩ nguồn gốc từ lồi khỉ xanh châu Phi. Virus human rhinovirus 1B (được cung cấp từ Manassas, VA, USA) được nuơi cấy vào tế bào HeLa. Các dịng tế bào HeLa và Vero được bảo quản trong mơi trường gồm 5- 10% huyết thanh bị (FBS) và 0,01% antibiotic-antimycotic. Dung dịch antibiotic- antimycotic, trypsin-EDTA, FBS, và MEM được cung cấp bởi Gibco BRL (Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Germany). Các đĩa cấy mơ được cung cấp bởi Falcon (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Sulforhodamine B (SRB) được cung cấp bởi Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Trước tiên các hợp chất được đánh giá độ độc tính đối với tế bào. Những hợp chất khơng gây độc tế bào là những chất cĩ giá trị CC50 (nồng độ tối thiểu gây độc 50% tế bào) >50M. Những chất này tiếp tục được đánh giá hoạt tính kháng virus.
Rupuntrivir được sử dụng làm chất đối chứng dương trong thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng virus CVB3 và EV71. Ribavirin được sử dụng làm chất đối chứng dương trong thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng virus HRV1B.
Các tế bào HeLa hoặc Vero được đưa vào đĩa 96 giếng (với mật độ 2 x 104 tế bào/giếng) và nuơi cấy ở điều kiện nêu trên trong 24 giờ. Ngày tiếp theo, loại bỏ tồn bộ mơi trường trong giếng, rửa sạch bằng PBS (photphat buffer saline), sau đĩ thêm vào 0,09 mL dung dịch pha lỗng chứa virus đảm bảo liều lượng TCID50 (liều gây nhiễm 50% tế bào nuơi cấy) và 0,01 mL hợp chất thử nghiệm hoạt tính, ủ ở điều kiện 37°C, 5% CO2 trong 2 ngày (mẫu thử). Hoạt tính kháng virus của mỗi hợp chất được theo dõi ở các nồng độ khác nhau 10 lần từ 0,1, 1,0, 10,0 và 100 μM. Bốn giếng chứa các tế bào nhiễm virus nhưng khơng được bơm chất thử nghiệm hoạt tính (mẫu
trắng), bốn giếng được bơm các tế bào khơng cấy virus để đối chứng (mẫu đối chứng âm). Sau khi rửa một lần với PBS, thêm vào mỗi giếng 100 ml acetone 70% lạnh (-
20°C) và ủ trong 30 phút ở -20°C. Sau đĩ, aceton được loại bỏ và tiến hành sấy 96 giếng ở 60°C trong 30 phút. Tiếp tục hút 100 μL SRB 0,4% trong axit acetic 1% thêm vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ trong phịng trong 30 phút tiếp theo. Rửa sạch các đĩa 5 lần bằng axit acetic 1%, rồi sấy khơ. Sau khi sấy trong 1 ngày, SRB cịn lại trong mỗi giếng được hịa tan bởi 100 μL dung dịch đệm Tris-base (10 mM), và để ở nhiệt độ trong phịng 30 phút.
Độ hấp thụ trong mỗi giếng được đo bằng VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Palo Alto, CA, USA) ở bước sĩng 540 nm. Hoạt tính kháng virus của mỗi hợp chất thử trong tế bào bị nhiễm CVB3, EV71 hoặc HRV1B được tính theo tỷ lệ phần trăm so với mẫu đối chứng.
Hoạt tính kháng virus được đánh giá bằng phần trăm tế bào sống sĩt:
%sống sĩt = ODmẫu thử− ODmẫu trắng
ODmẫu đối chứng âm− ODmẫu trắng× 100
Phân tích số liệu, xây dựng đồ thị và tính tốn giá trị IC50 (theo phương pháp hồi qui Sigmoidal dose-response) được thực hiện trên phần mềm GraphPad Prism 6.0.