Hợp chất VT16 thu được dưới dạng bột vơ định hình, màu trắng. Trên phở 1H- NMR của VT16 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại H 5,17 (br s), bảy nhĩm methyl tại H 0,69 (s), 0,71 (s), 0,84 (d, J = 6,5 Hz), 0,91 (s), 0,93 (s), 1,08 (s) và 1,29 (s), hai nhĩm oximethine tại H 2,75 (dd, J = 4,0, 9,5 Hz) và 3,42 (m). Phở 13C-NMR và DEPT của VT16 xuất hiện tín hiệu của 30 nguyên tử carbon, bao gồm bảy carbon methyl tại δC 16,3 2, 16,6, 17,1, 24,0, 26,4 và 28,8, tám carbon methylene tại δC 18,1, 23,2, 25,2, 25,9, 28,0, 32,6, 37,2 và 46,9, bảy carbon methine tại δC 41,4, 46,7, 53,2, 54,8, 67,2, 82,3 và 126,7, tám carbon khơng liên kết với hydro tại δC 37,6, 39,0, 39,2, 41,1, 47,0, 71,6, 138,6 và 178,9. Phân tích số liệu phở 1H- và 13C-NMR của hợp chất VT16 cho thấy hợp chất này cĩ cấu trúc khung urs-12-ene triterpene và cĩ số liệu phở tương tự với số liệu phở của tormentic acid [145]. Các tương tác HMBC giữa H-23 (δH 0,93)/H-24 (δH 0,71) và C-3 (δC 82,3)/C-4 (δC 39,0)/C-5 (δC 54,8) cho phép xác định vị trí nhĩm hydroxy tại C-3.
Bảng 3.19. Số liệu phở NMR của hợp chất VT16 và hợp chất tham khảo
C δC δCa,b DEPT δHa,c (J = Hz)
1 47,9 46,9 CH2 0,78 (br s) 1,78 (dd, 4,0, 12,5) 2 68,7 67,2 CH 3,42 (m) 3 83,9 82,3 CH 2,75 (dd, 4,0, 9,5) 4 39,8 39,0 C - 5 56,0 54,8 CH 0,77 (m) 6 19,0 18,1 CH2 1,33 (m) 1,47 (m) 7 33,5 32,6 CH2 1,23 (m) 1,45 (m) 8 40,4 39,2 C - 9 47,8 46,7 CH 1,62 (m) 10 38,5 37,6 C - 11 24,1 23,2 CH2 1,90 (m) 12 127,9 126,7 CH 5,17 (br s) 13 139,9 138,6 C - 14 42,1 41,1 C - 15 29,3 28,0 CH2 0,89 (m) 1,68 (m) 16 26,4 25,2 CH2 1,38 (m) 2,49 (m) 17 48,3 47,0 C - 18 54,6 53,2 CH 2,37 (s) 19 72,7 71,6 C - 20 42,4 41,4 CH 1,24 (m) 21 26,9 25,9 CH2 1,13 (m) 1,62 (m) 22 38,5 37,2 CH2 1,50 (m) 1,60 (m) 23 29,3 28,8 CH3 0,93 (s) 24 17,6 17,1 CH3 0,71 (s) 25 16,8 16,3 CH3 0,91 (s) 26 17,2 16,6 CH3 0,69 (s) 27 24,7 24,0 CH3 1,29 (s) 28 180,6 178,9 C - 29 27,1 26,4 CH3 1,08 (s) 30 16,3 16,3 CH3 0,84 (d, 6,5)
Các tương tác HMBC giữa H-1 (δH 0,78 và 1,78)/H-3 (δH 2,75) và C-2 (δC 67,2) đã gợi ý vị trí nhĩm hydroxy tại C-2. Các tương tác HMBC giữa H-29 (δH 1,08) và C-18 (δC 53,2)/C-19 (δC 71,6)/C-20 (δC 41,4); giữa H-30 (δH 0,84) và C-19 (δC 71,6)/C-20 (δC 41,4)/C-21 (δC 25,9) xác định vị trí nhĩm hydroxy cịn lại tại C-19. Các tương tác HMBC giữa H-27 (δH 1,29) và C-8 (δC 39,2)/C-13 (δC 138,6)/C-14 (δC 41,1)/C-15 (δC 28,0); giữa H-12 (δH 5,17) và C-9 (δC 46,7)/C-14 (δC 41,1)/C-18 (δC 53,2) đã chứng minh vị trí của liên kết đơi tại C-12/C-13. Từ những phân tích trên, hợp chất VT16 được khẳng định là tormentic acid.
3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được
3.2.1. Hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập từ lồi V. limonifolia
Các sản phẩm nguồn gốc tự nhiên cĩ hoạt tính chống viêm từ lâu đã được sử dụng như là một phương thuốc dân gian để điều trị sốt, đau và viêm khớp. Theo các báo cáo đã cơng bố, cĩ khá nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm của các lồi thuộc chi Vitex [17, 86, 89],…. Những hợp chất phân lập được từ chi Vitex thể hiện hoạt tính kháng viêm thường là những hợp chất labdane, flavonid, phenolic,… [11].
Viêm là hiện tượng bệnh lý bao gồm một loạt những thay đởi tại chỗ và tồn thân, bắt đầu ngay khi tác nhân gây viêm xâm nhập vào cơ thể. Viêm nhiễm là căn bệnh rất phở biến ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Viêm là một đáp ứng của hệ miễn dịch bảo vệ cơ thể trước sự tấn cơng của tác nhân bên ngồi (vi sinh vật, tác nhân hĩa, lý, cơ) hoặc của tác nhân bên trong (hoại tử do thiếu máu cục bộ, bệnh tự miễn). Quá trình viêm kéo dài sẽ cĩ thể trở thành viêm mạn tính, gây ra các bệnh viêm nhiễm. Trong phản ứng viêm, các tế bào như bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào, bạch cầu ưa acid, bạch cầu ưa bazơ, tế bào nội mơ sản xuất ra các chất trung gian hố học như prostaglandin, histamin, leucotrien,… Các chất trung gian hố học vừa giải phĩng lại hoạt hố một số tế bào khác, giải phĩng các polypeptid gọi là các cytokin [146].
Các chất hay thuốc kháng viêm khơng đảo ngược được quá trình viêm mà chỉ giới hạn hoặc làm chậm quá trình viêm bằng cách ức chế việc sản xuất các chất trung gian gây viêm [105].
Để đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro thơng qua sự sản sinh NO trên dịng tế bào BV2, kích thích bởi LPS của 12 hợp chất (VL1-VL12) từ lồi V. limonifolia,
đầu tiên các hợp chất này được đánh giá độ độc trên dịng tế bào BV2 ở nồng độ 20
M. Các hợp chất cĩ độc tính mạnh (% tế bào sống sĩt < 80%) khơng được lựa chọn
để đánh giá hoạt tính kháng viêm. Kết quả sàng lọc cho thấy hợp chất VL11 cĩ độc tính mạnh (tỉ lệ sống sĩt 59,04% < 80%), khơng được lựa chọn đánh giá hoạt tính kháng viêm. Các hợp chất cịn lại khơng gây độc dịng tế bào BV2 (tỉ lệ sống sĩt > 80%) (Xem hình dưới). VL 1 VL 2 VL 3 VL 4 VL 5 VL 6 VL 7 VL 8 VL 9 VL 1 0 VL 1 1 VL 1 2 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 H ỵ p c h Ê t % s è n g s ĩ t
Hình 3.74. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng viêm của các hợp chất VL1-VL12
Tiếp đĩ, các hợp chất VL1-VL10, VL12 được đánh giá sàng lọc ức chế sự sản sinh NO trên dịng tế bào BV2, kích thích bởi LPS ở 50 µM. Kết quả sàng lọc cho thấy tất cả các hợp chất được đánh giá đều thể hiện tác dụng ức chế sự sản sinh NO mạnh (% ức chế >50%) vì thế được đánh giá ở các nồng độ nhỏ hơn: 1,0, 5,0, 10, 20 µM để xác định giá trị IC50. Các hợp chất VL2 và VL3 gây ức chế mạnh sự sản sinh NO mạnh nhất với giá trị IC50 lần lượt là 2,500,34 và 7,130,87 M. Các hợp chất VL6 và VL10 thể hiện khả năng ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2 với giá trị IC50 lần lượt là 19,161,09, 15,881,17 M, mạnh hơn chất đối chứng dương L-NMMA (IC50 22,101,20 M). Bốn hợp chất VL4, VL5, VL7 và VL9 cũng gây ức chế đáng kể sự sản sinh NO với các giá trị IC50 nằm trong khoảng 24,70 đến 45,31 M (Thấp hơn chất đối chứng dương, L-NMMA).
Từ các kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2 của các hợp chất từ lồi V. limonifolia đã gợi ý một số nhận định ban đầu về mối liên hệ giữa cấu trúc hĩa học và hoạt tính kháng viêm của các hợp chất này như sau:
- Trong số các hợp chất labdane phân lập được (VL1-VL3), hợp chất VL2,
VL3 thể hiện hoạt tính ức chế mạnh sự sản sinh NO trên tế bào BV2 (giá trị IC50 lần
lượt là 2,500,34, 7,130,87 M) trong cấu trúc phân tử cĩ nhĩm hydroxy tại C-16, trong khi hợp chất VL1 (hoạt tính yếu) khơng cĩ nhĩm hydroxy ở vị trí trên; đặc biệt hợp chất VL2 cĩ thêm nhĩm hydroxy tại C-12 so với hợp chất VL3 thì thể hiện hoạt tính ức chế NO mạnh hơn.
- Các hợp chất flavonoid phân lập được (VL4, VL5 và VL6) thể hiện hoạt tính ức sự sản sinh NO ở mức độ trung bình (giá trị IC50 từ 19,16 đến 39,67 M).
3.2.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất
Enterovirus là tên gọi chung của nhĩm siêu vi thuộc họ Picornaviridae, cĩ đặc điểm bộ gen là ARN, sợi đơn, cấu trúc virus khơng cĩ lớp vỏ bao ngồi envelope. Các entrovirus gây nhiễm ở vùng họng và đường tiêu hĩa. Cĩ hơn 70 loại enterovirus, được xem vào các nhĩm sau: echovirus, coxsackievirus A, coxsackievirus B, enterovirus 68–71 và poliovirus [147]. Đặc điểm chung của các siêu vi trong nhĩm này là sinh sản và lây lan từ người mang mầm bệnh sang người lành qua đường tiêu hĩa hoặc hơ hấp. Con người là vật chủ duy nhất của enterovirus. Dịch bệnh này thường xảy ra vào mùa hè và mùa thu. Trẻ em thường dễ bị nhiễm enterovirus hơn người lớn, đặc biệt là trẻ từ 1 đến 4 tuởi [147].
Enterovirus gây ra rất nhiều chứng bệnh khác nhau. Đa số các trường hợp nhiễm cĩ biểu hiện nhẹ và tự hồi phục mà khơng cần phải điều trị. Một số ít các trường hợp cĩ biến chứng thần kinh như viêm não, viêm màng não hoặc bại liệt. Các trường hợp cĩ biểu hiện nhẹ, thì triệu chứng cĩ thể gặp của bệnh là sốt, phát ban, tiêu chảy, viêm họng và nởi mụn nước ở trong miệng, lịng bàn tay, chân và vùng mơng. Trường hợp cĩ biến chứng thần kinh thì cĩ thể gặp những triệu chứng như mê sảng, lơ mơ, co giật, hơn mê, yếu liệt chân tay, khĩ thở [148]. Mỗi năm, entrovirrus lây nhiễm hàng triệu người trên thế giới với nhiều triệu chứng khác nhau. Tại Mỹ, entrovirus gây ra 30 000 đến 50 000 trường hợp viêm màng não mỗi năm trên khoảng 30 đến 50 triệu ca nhiễm bệnh do Entrovirrus gây ra [148]. Các ca nhiễm enterovirus cĩ triệu chứng lâm sàng khơng đặc trưng nên thường cĩ thể bị chẩn đốn sai thành nhiễm bệnh do vi khuẩn hoặc siêu vi khác, dẫn đến điều trị, thủ thuật khơng cần thiết. Gần đây, với sự tiến bộ của cơng nghệ chẩn đốn chính xác virus trong cơ thể và sự
phát triển của các liệu pháp kháng virus mới, các trường hợp nhiễm enterovirus nặng đã được chẩn đốn và điều trị sớm hơn [147]. Tuy nhiên, cho đến nay, trên thế giới vẫn chưa cĩ loại vắc xin nào phịng ngừa nhiễm các loại entrovirus, cũng như chưa cĩ thuốc điều trị đặc hiệu được FDA cơng nhận dùng cho các bệnh do nhiễm entrovirus [149].
Kết quả nghiên cứu về hoạt tính kháng virus in vitro đối với một số chủng
virus entrovirus của các hợp chất phân lập được từ lồi V.limonifolia và V. trifolia
như sau:
3.2.2.1. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất từ lồi V. limonifolia
Các hợp chất VL1-VL12 phân lập được từ lồi V. limonifolia được tiến hành đánh giá hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3 (CVB3), human rhinovirus 1B (HRV1B) và enterovirus 71 (EV71). Kết quả cho thấy, hai hợp chất flavonoid VL4 và VL6 thể hiện hoạt tính kháng virus mạnh đối với tế bào nhiễm
virus CVB3 với các giá trị IC50 lần lượt là 0,21 ± 0,06, 1,86 ± 0,18 μM và đều cĩ giá trị CC50 >50 µM (chất đối chứng dương rupintrivir cĩ IC50 là 0,12 ± 0,06 μM). Đồng thời, hợp chất VL4 cịn thể hiện tác dụng ức chế virus HVR1B (với giá trị IC50 là 0,61±0,21 μM và CC50 >50 µM) mạnh hơn so với chất đối chứng dương ribavirin (IC50 là 48,07±1,46 μM). Hợp chất này cũng thể hiện hoạt tính kháng virus EV71 ở mức độ trung bình (với giá trị IC50 là 32,05±0,94 μM). Kết quả này cho thấy phạm vi kháng virus của hợp chất VL4 đối với các chủng entrovirus khá rộng.
Các kết quả về hoạt tính kháng virus enterovirus của các hợp chất từ lồi V.
limonifolia cho thấy 2 hợp chất khung flavonoid (VL4 và VL6) thể hiện hoạt tính
kháng virus mạnh. Nhiều cơng trình nghiên cứu đã cơng bố cũng cho thấy khả năng kháng một số chủng enterovirus của các hợp chất flavonoid. Nyo Min và cộng sự đã tiến hành sàng lọc hoạt tính kháng virus enterovirus A71 của các hợp chất flavonoid và cho thấy 2 hợp chất ST077124 (6-hydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)- 3,5,7-trimethoxychromen-4-one) và ST024734 (peracetate pulicarine) thể hiện hoạt tính kháng virus mạnh, hứa hẹn sẽ là tác nhân điều trị EVA71[150]. Trong một cơng bố khác, từ lồi S. baicalensis Georgi, Choi và cộng sự đã phân lập được 3 flavonoid là norwogonin, oroxylin A, mosloflavone và đánh giá hoạt tính kháng virus EV71. Kết quả cho thấy những hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng virus EV71 mạnh, cĩ
tác dụng ức chế sự tởng hợp lớp vỏ capsid của virus [119]. Một flavonoid được phân lập từ lồi Larix sibirica, dihydroquercetin, trong thử nghiệm trên chuột để điều trị bệnh viêm tụy gây ra bởi virus coxsackievirus B4 đã cho thấy tác dụng kháng virus mạnh của dihydroquercetin. Điều này gợi mở khả năng ứng dụng của hợp chất này trong điều trị viêm tụy do virus [151]. Như vậy kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng virus in vitro từ các hợp chất phân lập từ lồi V. limonifolia đã gĩp phần gợi mở mối liên hệ về khả năng kháng các chủng enterovirus của hợp chất flavonoid.
3.2.2.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất từ lồi V. trifolia
Các hợp chất VT1-VT16 đã được phân lập từ lồi V. trifolia đã được đánh giá khả năng ức chế đối với ba chủng entrovirus là CVB3, HRV1B và EV71 ở nồng độ 10 M. Kết quả được thể hiện như hình dưới đây:
VT1VT2VT3VT4VT5VT6VT7VT8VTV9T1 0VT1 1VT1 2VT1 3VT1 4VT1 5VT1 6 - 2 0 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 H ỵ p c h Ê t % s è n g s ĩ t C V B 3 Hình 3.75. Tác dụng kháng virus CVB3 của các hợp chất VT1-VT16 VT 1VT 2VT 3VT 4VT 5VT 6VT 7VT 8VT 9VT 1 0 VT 1 1 VT 1 2 VT 1 3 VT 1 4 VT 1 5 VT 1 6 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 H ỵ p c h Ê t % s è n g s ĩ t H R V 1 B Hình 3.76. Tác dụng kháng virus HRV1B của các hợp chất VT1-VT16
VT 1VT 2VT 3VT 4VT 5VT 6VT 7VT 8VT 9VT 1 0 VT 1 1 VT 1 2 VT 1 3 VT 1 4 VT 1 5 VT 1 6 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 H ỵ p c h Ê t % s è n g s ĩ t E V 7 1
Hình 3.77. Tác dụng kháng virus EV71 của các hợp chất VT1-VT16
Qua đánh giá sơ bộ về hoạt tính kháng một số chủng entrovirus, hợp chất VT9 cho thấy hiệu quả tác dụng chống lại các chủng virus CVB3/ HRV1B/ EV71 ở nồng độ 10 M với giá trị tỉ lệ phần trăm tế bào sống sĩt lần lượt là 77,14%, 80,20%, 43,35%. Các hợp chất cịn lại khơng thể hiện hoạt tính kháng các chủng virus thử nghiệm.
Liên hệ giữa kết quả đánh giá hoạt tính kháng virus của các hợp chất phân lập được từ lồi V. trifolia và cấu trúc của các hợp chất này cho một số nhận xét như sau: Hợp chất VT9 thể hiện tiềm năng kháng virus cĩ cấu trúc khung flavonoid, điều này phù hợp với mối liên hệ giữa khả năng kháng các chủng enterovirus với cấu trúc khung flavonoid như đã nêu ở mục 3.2.2.1. Trong khi đĩ, hợp chất VT10 cũng là một flavonoid, cĩ cấu trúc gần giống VT9 nhưng khơng thể hiện hoạt tính kháng các chủng virus thử nghiệm. So sánh cấu trúc của hai hợp chất này, cho thấy hợp chất VT10
khơng cĩ hai nhĩm thế hydroxy tại vị trí C-5 và C-5. Các hợp chất flavonoid khác phân lập được từ lồi V. trifolia (VT11, VT12, VT13, VT14) khơng thể hiện hoạt tính kháng các chủng virus thử nghiệm trong cấu trúc cũng khơng cĩ nhĩm hydroxy tại vị trí C-5.
KẾT LUẬN
Từ lá của 2 lồi Vitex limonifolia và Vitex trifolia thu hái tại vườn quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên Huế sau khi xử lý ngâm, chiết và tiến hành phân lập bằng các phương pháp sắc ký và các phương pháp phở hiện đại, cĩ sự so sánh các số liệu phở với các hợp chất tương tự trong tài liệu tham khảo, chúng tơi đã phân lập và xác định cấu trúc 28 hợp chất và nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất này.
1. Từ lồi Vitex limonifolia đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp chất.
Trong đĩ, cĩ 3 hợp chất mới là vitexlimolide A (VL1), vitexlimolide B (VL2) và
vitexlimolide C (VL3); 5 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Vitex là 5,4′- dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone (VL4), 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone (VL6), verrucosin (VL7), 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien- 28-oic acid (VL10) và maltol O-β-D-glucopyranoside (VL12); và 4 hợp chất đã biết khác là vitecetin (VL5), 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (VL8), euscaphic acid (VL9) và maslinic acid (VL11).
2. Từ lồi Vitex trifolia đã phân lập và xác định cấu trúc 16 hợp chất. Trong
đĩ, cĩ 2 hợp chất mới là 3α-hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic acid (VT1) và
matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (VT2); 1 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ
chi Vitex là 20-hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide (VT5); 3 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ lồi V. trifolia là ecdysone (VT3), 20-hydroxyecdysone (VT4) và
turkesterone (VT6); và 10 hợp chất đã biết là polypodine B (VT7), rubrosterone (VT8), luteolin (VT9), (2S)-7,4'-dihydroxy-5-methoxyflavanone (VT10), vitexin (VT11), orientin (VT12), homoorientin (VT13), 2-O-rhamnosylvitexin (VT14), euscaphic acid (VT15) và tormentic acid (VT16).
3. Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vitro thơng qua ức chế sự sản sinh
NO trên tế bào BV2 của 12 hợp chất (VL1 - VL12) phân lập được từ lồi Vitex limonifolia. Kết quả cho thấy, các hợp chất VL2, VL3 thể hiện hoạt tính kháng viêm
mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 2,500,34, 7,130,87 M; hợp chất VL6, VL10 thể hiện hoạt tính kháng viêm với giá trị IC50 lần lượt là 19,161,09, 15,881,17 M, giá trị này nhỏ hơn so với chất đối chứng dương được sử dụng là L-NMMA (IC50 là