CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.4. Thơng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được
2.4.1.1. Hợp chất VL1: 7α,12α-Dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide (Vitexlimolide A) (hợp
(Vitexlimolide A) (hợp chất mới)
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : –24,0 (c 0,1, MeOH). HR-ESI-MS: m/z 369,1830 [M+Cl]‒.
Tính tốn lý thuyết [C20H30O4Cl]‒: 369,1838. Cơng thức phân tử C20H30O4, M = 334.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.1.
2.4.1.2. Hợp chất VL2: 7α,12β,16-Trihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide
(Vitexlimolide B) (hợp chất mới)
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : –16,0 (c 0,1, MeOH). HR-ESI-MS: m/z 385,1772 [M+Cl]‒.
Tính tốn lý thuyết [C20H30O5Cl]‒: 385,1787. Cơng thức phân tử: C20H30O5, M = 350.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.2
2.4.1.3. Hợp chất VL3: 7α,16-Dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide (Vitexlimolide C) (hợp chất mới)
Chất bột vơ định hình, màu trắng Độ quay cực 25
D
[ ] : –24,0 (c 0,1, MeOH) HR-ESI-MS: m/z 357,2036 [M+Na]+.
Tính tốn lý thuyết [C20H30O4Na]+: 357,2036. Cơng thức phân tử: C20H30O4, M = 334.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.3.
2.4.1.4. Hợp chất VL4: 5,4′-Dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone
Chất bột màu vàng.
HR-ESI-MS: m/z 313,0711 [M-H]‒.
Cơng thức phân tử: C17H14O6, M = 314.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.4.
2.4.1.5. Hợp chất VL5: Vitecetin
Chất bột màu vàng.
HR-ESI-MS: m/z 359,0752 [M-H]‒.
Tính tốn lý thuyết [C18H15O8]‒ : 359,0772. Cơng thức phân tử: C18H16O8, M = 360.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.5.
2.4.1.6. Hợp chất VL6: 5,4′-Dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone
Chất bột màu vàng.
HR-ESI-MS: m/z 313,0712 [M-H]‒.
Tính tốn lý thuyết [C17H13O6]‒ : 313,0718. Cơng thức phân tử: C17H14O6, M = 314.
1H-NMR (DMSO-d6): H 6,93 (s, H-2), 6,35 (s, H-6), 6,76 (s, H-8), 7,57 (s, H-2′), 6,94 (d, J = 7,5 Hz, H-5′), 7,58 (d, J = 7,5 Hz, H-6′), 3,90 (s, 7-OMe), 3,86 (s, 3′- OMe). 13C-NMR (DMSO-d6): C 161,1 (C-2), 103,3 (C-3), 181,9 (C-4), 164,0 (C-5), 97,9 (C-6), 165,1 (C-7), 92,7 (C-8), 157,2 (C-9),104,7 (C-10), 121,4 (C-1′), 110,2 (C-2′), 148,0 (C-3′), 150,9 (C-4′), 115,8 (C-5′), 120,5 (C-6′), 56,0 (7-OMe), 56,0 (3′-OMe). 2.4.1.7. Hợp chất VL7: Verrucosin
Dạng dầu, khơng màu. Độ quay cực 25
D
[ ] : +12,0 (c 0,1, CHCl3). HR-ESI-MS: m/z 343,1544 [M-H]‒.
Tính tốn lý thuyết [C20H23O5]‒: 343,1551. Cơng thức phân tử: C20H24O5, M = 344.
1H-NMR (CDCl3): H 5,11 (d, J = 8,5 Hz, H-2), 2,24 (m, H-3), 1,77 (m, H-4), 4,39 (d, J = 9,5 Hz, H-5), 7,04 (d, J = 1,5 Hz, H-2′), 6,92 (d, J = 8,0 Hz, H-5′), 6,99 (dd, J = 1,5, 8,0 Hz, H-6′), 6,85 (d, J = 1,5 Hz, H-2′′), 6,88 (d, J = 8,0 Hz, H-5′′), 6,82 (dd,
J = 1,5, 8,0 Hz, H-6′′), 3,86 (s, 3′-OMe), 3,91 (s, 3′′-OMe), 1,05 (d, J = 7,0 Hz, 3-
13C-NMR (CDCl3): C 87,4 (C-2), 47,8 (C-3), 46,0 (C-4), 83,2 (C-5), 133,2 (C-1′), 109,4 (C-2′), 146,5 (C-3′), 145,2 (C-4′), 114,2 (C-5′), 119,3 (C-6′), 132,8 (C-1′′), 109,8 (C-2′′), 146,2 (C-3′′), 144,6 (C-4′′), 113,9 (C-5′′), 119,9 (C-6′′), 55,9 (3′-OMe), 55,9 (3′′-OMe), 15,0 (3-Me), 15,0 (4-Me).
2.4.1.8. Hợp chất VL8: 2α,3α-Dihydroxyurs-12-en-28-oic acid
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : +30,0 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C30H48O4, M= 472.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.6.
2.4.1.9. Hợp chất VL9: Euscaphic acid
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : +20,0 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C30H48O5, M = 488.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.7.
2.4.1.10. Hợp chất VL10: 2α,3α-Dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-
28-oic acid
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : –40,0 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C30H46O5, M = 486.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.8.
2.4.1.11. Hợp chất VL11: Maslinic acid
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : –64,1 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C30H48O4, M = 472.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.9.
2.4.1.12. Hợp chất VL12: Maltol O-β-D-glucopyranoside
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : –15,0 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C12H16O8, M = 288.
2.4.2. Các thơng số vật lí của các hợp chất phân lập được từ lồi V. trifolia
2.4.2.1. Hợp chất VT1: 3α-Hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic acid (hợp chất mới)
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : +50,0 (c 0,1, MeOH). HR-ESI-MS: m/z 455,3540 [M-H]‒.
Tính tốn lý thuyết [C30H47O3]‒: 455,3531. Cơng thức phân tử: C30H48O3, M = 456.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (CDCl3): xem Bảng 3.11.
2.4.2.2. Hợp chất VT2: Matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (hợp chất mới)
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25 D [ ] : –18,0 (c 0,1, MeOH). CD (c=1,0×10‒3, MeOH): [θ]25 (rel, nm) ‒1,00 (226), ‒0,21 (275) HR-ESI-MS: m/z 521,2009 [M+H]+. Tính tốn lý thuyết [C26H33O11]+: 521,2017. Cơng thức phân tử: C26H32O11, M = 520
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.12.
2.4.2.3. Hợp chất VT3: Ecdysone
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : +70,0 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C27H44O6, M = 464.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.13.
2.4.2.4. Hợp chất VT4: 20-Hydroxyecdysone
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : +52,0 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C27H44O7, M = 480.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.14.
2.4.2.5. Hợp chất VT5: 20-Hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : +50,0 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C30H48O7, M = 520.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.15.
2.4.2.6. Hợp chất VT6: Turkesterone
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : +85,0 (c 0,1, MeOH). HR-ESI-MS: m/z 495,2950 [M-H]‒.
Tính tốn lý thuyết [C27H43O8]‒: 495,2963. Cơng thức phân tử: C27H44O8, M = 496.
1H-NMR (CD3OD): H 4,03 (ddd, J = 3,0, 4,0, 12,0 Hz, H-2), 3,98 (br d, J = 2,0 Hz, H-3), 2,36 (dd, J = 4,0, 13,0 Hz, H-5), 5,82 (d, J = 2,5 Hz, H-7), 3,17 (dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-9), 4,13 (m, H-11), 0,90 (s, H-18), 1,08 (s, H-19), 1,23 (s, H-21), 3,37 (m, H- 22), 1,22 (s, H-24), 1,22 (s, H-27). 13C-NMR (CD3OD): C 39,1 (C-1), 68,9 (C-2), 68,6 (C-3), 33,3 (C-4), 52,8 (C-5), 206,7 (C-6), 122,7 (C-7), 165,7 (C-8), 42,9 (C-9), 39,9 (C-10), 69,5 (C-11), 43,8 (C- 12), 49,0 (C-13), 84,9 (C-14), 31,9 (C-15), 21,5 (C-16), 50,3 (C-17), 18,9 (C-18), 24,6 (C-19), 77,8 (C-20), 21,0 (C-21), 78,4 (C-22), 27,3 (C-23), 42,4 (C-24), 71,3 (C- 25), 29,0 (C-26), 29,7 (C-27). 2.4.2.7. Hợp chất VT7: Polypodine B
Chất bột vơ định hình, màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : +94,2 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C27H44O8, M = 496.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.16.
2.4.2.8. Hợp chất VT8: Rubrosterone
Chất bột màu trắng. Độ quay cực 25
D
[ ] : +120,0 (c 0,1, MeOH) Cơng thức phân tử: C19H26O5, M = 334.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (CD3OD): xem Bảng 3.17.
2.4.2.9. Hợp chất VT9: Luteolin
Chất bột màu vàng.
Cơng thức phân tử: C15H10O6, M = 286.
1H-NMR (CD3OD): H 6,55 (s, H-3), 6,22 (d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,45 (d, J = 2,0 Hz, H-8), 7,39* (H-2), 6,92 (d, J = 8,5 Hz, H-5), 7,39* (H-6). (*Tín hiệu chập).
13C-NMR (CD3OD): C 166,0 (C-2), 103,9 (C-3), 183,9 (C-4), 163,2 (C-5), 100,1 (C-6), 166,4 (C-7), 95,0 (C-8), 159,4 (C-9), 105,3 (C-10), 123,7 (C-1), 114,2 (C-2), 147,0 (C-3), 151,0 (C-4), 116,8 (C-5), 120,3 (C-6). 2.4.2.10. Hợp chất VT10: (2S)-7,4'-Dihydroxy-5-methoxyflavanone Chất bột màu vàng. Độ quay cực 25 D [ ] : -20,5 (c 0,1, MeOH) Cơng thức phân tử: C16H14O5, M = 286.
Số liệu phở 1H- và 13C-NMR (DMSO-d6): xem Bảng 3.18.
2.4.2.11. Hợp chất VT11: Vitexin
Chất bột màu vàng. Độ quay cực 25
D
[ ] : +9,1 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C21H20O10, M = 432.
1H-NMR (DMSO-d6): H 6,77 (s, H-3), 6,28 (s, H-6), 8,02 (d, J = 8,5 Hz, H-2′), 6,89 (d, J = 8,5 Hz, H-3′), 4,69 (d, J = 10 Hz, H-1′′). 13C-NMR (DMSO-d6): C 164,0 (C-2), 102,5 (C-3), 182,1 (C-4), 160,4 (C-5), 98,1 (C-6), 162,5 (C-7), 104,6 (C-8), 156,0 (C-9), 104,1 (C-10), 121,6 (C-1′), 129,0 (C- 2′), 115,8 (C-3′), 161,1 (C-4′), 115,8 (C-5′), 129,0 (C-6′), 73,4 (C-1), 70,9 (C-2), 78,7 (C-3), 70,6 (C-4), 81,8 (C-5), 61,3 (C-6). 2.4.2.12. Hợp chất VT12: Orientin Chất bột màu vàng. Độ quay cực 25 D [ ] : +20,0 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C21H20O11, M = 448.
1H-NMR (CD3OD): H 6,63 (s, H-3), 6,26 (s, H-6), 7,48 (s, H-2′), 6,86 (d, J = 8,0 Hz, H-5′), 7,53 (d, J = 8,0 Hz, H-6′), 4,68 (d, J = 10 Hz, H-1′′). 13C-NMR (CD3OD): C 164,1 (C-2), 102,3 (C-3), 182,0 (C-4), 160,4 (C-5), 98,1 (C- 6), 162,7 (C-7), 104,5 (C-8), 156,0 (C-9), 104,0 (C-10), 121,9 (C-1′), 114,0 (C-2′), 145,8 (C-3′), 149,7 (C-4′), 115,6 (C-5′), 119,3 (C-6′), 73,4 (C-1), 70,8 (C-2), 78,7 (C-3), 70,7 (C-4), 82,0 (C-5), 61,6 (C-6). 2.4.2.13. Hợp chất VT13: Homoorientin Chất bột màu vàng.
Độ quay cực 25 D
[ ] : +28,5 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C21H20O11, M = 448.
1H-NMR (DMSO-d6): H 6,67 (s, H-3), 6,48 (s, H-8), 7,41 (d, J = 2,0 Hz, H-2′), 6,89 (d, J = 8,0 Hz, H-5′), 7,41 (dd, J = 2,0, 10,0 Hz, H-6′), 4,59 (d, J = 10,0 Hz, H-1′′). 13C-NMR (DMSO-d6): C 163,3 (C-2), 102,8 (C-3), 181,9 (C-4), 160,7 (C-5), 108,9 (C-6), 163,7 (C-7), 93,5 (C-8), 156,2 (C-9), 103,4 (C-10), 121,4 (C-1′), 113,3 (C-2′), 145,8 (C-3′), 149,7 (C-4′), 116,1 (C-5′), 119,0 (C-6′), 73,1 (C-1), 70,6 (C-2), 79,0 (C-3), 70,2 (C-4), 81,6 (C-5), 61,5 (C-6). 2.4.2.14. Hợp chất VT14: 2-O-Rhamnosylvitexin Chất bột màu vàng. Độ quay cực 25 D [ ] : +30,0 (c 0,1, MeOH). Cơng thức phân tử: C27H30O14, M = 578.
1H-NMR (CD3OD): H 6,62 (s, H-3), 6,26 (s, H-6), 8,01 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′/H- 6′), 6,97 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3′/H-5′), 5,06 (d, J = 10,0 Hz, H-1′′), 5,11* (H-1′′′). 13C-NMR (CD3OD): C 166,7 (C-2), 103,6 (C-3), 184,1 (C-4), 162,7 (C-5), 100,1 (C- 6), 164,9 (C-7), 105,8 (C-8), 158,0 (C-9), 105,8 (C-10), 123,6 (C-1′), 130,1 (C-2′), 117,0 (C-3′), 162,8 (C-4′), 117,0 (C-5′), 130,1 (C-6′), 73,8 (C-1), 78,2 (C-2), 81,6 (C-3), 72,3 (C-4), 82,9 (C-5), 63,1 (C-6), 102,5 (C-1), 72,5 (C-2), 72,0 (C- 3), 73,6 (C-4), 70,0 (C-5), 18,0 (C-6).(*Tín hiệu chập). 2.4.2.15. Hợp chất VT15: Euscaphic acid Xem VL9 2.4.2.16. Hợp chất VT16: Tormentic acid
Chất bột vơ định hình màu trắng Độ quay cực 25
D
[ ] :+29,0 (c 0,1, MeOH) Cơng thức phân tử: C30H48O5, M = 488.
2.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được
2.5.1. Hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập được từ lồi V. limonifolia limonifolia
Các hợp chất VL1- VL12 được đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa trên khả năng ức chế sự sản sinh NO được sinh ra bởi tế bào BV2, kích thích bởi LPS.
Đầu tiên, các hợp chất được kiểm tra độ độc của chúng đối với tế bào ở nồng độ 20 µM. Những hợp chất khơng thể hiện độc tính (VL1-VL10, VL12) tiếp tục được đánh giá sàng lọc ức chế sự sản sinh NO trên dịng tế bào BV2, kích thích bởi LPS ở 50 µM. Những chất thử nghiệm đều cĩ khả năng ức chế mạnh sự sản sinh NO do tế bào BV2 sinh ra (% ức chế >50%) nên tiếp tục được đánh giá ở các nồng độ khác nhau: 1,0, 5,0, 10, 20 µM để xác định giá trị IC50. Chất đối chứng dương sử dụng trong thí nghiệm là L-NMMA, một loại chất ức chế sản sinh NO, với giá trị IC50 là 22,11,20 µM.
Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào BV2, được kích thích bởi LPS của 12 hợp chất (VL1-VL12) ở nồng độ 20 µM được thể hiện như bảng dưới đây.
Bảng 2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh NO của các hợp chất
VL1-VL12 trên tế bào BV2 Hợp chất % tế bào sống sĩt IC50 (µM) VL1 87,062,43 >50 VL2 120,757,80 2,500,34 VL3 147,828,55 7,130,87 VL4 87,1211,28 24,701,52 VL5 104,519,50 39,673,14 VL6 86,633,23 19,161,09 VL7 96,935,10 45,315,31 VL8 104,519,50 >50 VL9 141,198,73 44,232,48 VL10 119,536,65 15,881,17 VL11 59,045,83 - VL12 80,503,25 >50 L-NMMA 22,101,20
2.5.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất
Từ lồi V. limonifolia
12 hợp chất VL1-VL12 phân lập được từ lồi V. limonifolia được tiến hành
đánh giá hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3 (CVB3), human rhinovirus 1B (HRV1B) và enterovirus 71 (EV71) theo phương pháp thử nghiệm SRB. Rupuntrivir và ribavirin được sử dụng làm chất đối chứng dương.
Kết quả cho thấy, 2 hợp chất flavonoid VL4 và VL6 thể hiện hoạt tính kháng virus mạnh (Bảng 2.2). Đồng thời, các hợp chất VL4 và VL6 khơng thể hiện độc tính đối với tế bào (dữ liệu khơng được hiển thị).
Bảng 2.2. Hoạt tính kháng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B và
enterovirus 71 của một số hợp chất từ lồi V. limonifolia.
Kí hiệu CC50 (M) IC50 (M) Coxsackievirus B3 (CVB3) VL4 >50 0,21±0,06 VL6 >50 1,86±0,18 Rupuntrivir >50 0,12±0,06 Human rhinovirus 1B (HRV1B) VL4 >50 0,61±0,21 Ribavirin >50 48,07±1,46 Enterovirus 71 (EV71) VL4 >50 32,05±0,94 Rupuntrivir >50 0,11±0,05 Từ lồi V. trifolia
Các hợp chất VT1-VT16 được phân lập từ lồi V. trifolia trước tiên được đánh giá sàng lọc hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B và enterovirus 71.
Kết quả đánh giá sơ bộ hoạt tính kháng các chủng virus CVB3/ HRV1B/ EV71 của các hợp chất VT1-VT16 ở nồng độ 10 M được trình bày ở bảng dưới đây.
Bảng 2.3. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng một số chủng virus của các hợp chất
từ lồi V. trifolia
Hợp chất % tế bào sống sĩt
Coxsackievirus B3 Human rhinovirus 1B Enterovirus 71
VT1 2,38 5,41 1,30 VT2 3,52 4,23 5,97 VT3 4,99 -1,51 -4,34 VT4 13,27 0,71 3,37 VT5 1,94 -0,12 2,29 VT6 -2,31 -1,87 -5,16 VT7 4,20 -3,10 6,44 VT8 1,85 -0,68 1,42 VT9 77,14 80,20 43,35 VT10 -5,98 -1,75 -4,99 VT11 3,44 1,03 -4,94 VT12 1,89 -3,34 -1,17 VT13 6,23 -0,95 -1,87 VT14 -0,63 -0,20 1,53 VT15 -0,19 -2,30 -0,19 VT16 1,32 -1,79 -8,83
Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng virus của các hợp chất phân lập được từ lồi
V. trifolia cho thấy, chỉ cĩ hợp chất VT9 thể hiện hiệu quả kháng các chủng virus
CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được 3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được
Tởng số 28 hợp chất đã được phân lập và xác định được cấu trúc từ hai lồi V.
limonifolia và V. trifolia, trong đĩ cĩ:
* 12 hợp chất từ lồi V. limonifolia (Hình 3.1):
3 hợp chất diterpenoid khung labdane, đều là hợp chất mới được đặt tên là vitexlimolide A (VL1), vitexlimolide B (VL2) và vitexlimolide C (VL3); 9 hợp chất đã biết gồm: ba hợp chất flavonoid, 5,4′-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone (VL4), vitecetin (VL5), 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone (VL6); 1 hợp chất lignan, verrucosin (VL7); 4 hợp chất triterpenoid khung ursane và oleanane, 2α,3α- dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (VL8), euscaphic acid (VL9), 2α,3α-dihydroxy-19- oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid (VL10), maslinic acid (VL11); và 1 hợp chất -pyrone glycoside, maltol O-β-D-glucopyranoside (VL12). Trong đĩ, các hợp chất VL4, VL6, VL7, VL10 và VL12 lần đầu tiên phân lập từ chi Vitex.
* 16 hợp chất từ lồi V. trifolia (Hình 3.2):
Một hợp chất mới triterpene khung lanostane, 3α-hydroxylanosta-8,24E-dien- 26-oic acid (VT1); 1 hợp chất mới khung lignan, matairesinol 4′-O-β-D- glucopyranoside (VT2); và 14 hợp chất đã biết gồm: 6 hợp chất ecdysteroid, ecdysone (VT3), 20-hydroxyecdysone (VT4), 20-hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide (VT5), turkesterone (VT6), polypodine B (VT7), rubrosterone (VT8); 6 hợp chất flavonoid, luteolin (VT9), (2S)-7,4'-dihydroxy-5-methoxyflavanone (VT10), vitexin (VT11), orientin (VT12), homoorientin (VT13), 2-O-rhamnosylvitexin (VT14); 2 hợp chất triterpene khung ursane, euscaphic acid (VT15) và tormentic acid (VT16).
Trong đĩ, hợp chất VT5 lần đầu tiên phân lập từ chi Vitex, các hợp chất VT3,
VT4, VT6 lần đầu tiên phân lập từ lồi V. trifolia.
3.1.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ lồi V. limonifolia
3.1.1.1. Hợp chất VL1: Vitexlimolide A (hợp chất mới)
Hình 3.3. Cấu trúc hĩa học của hợp chất VL1 và hợp chất tham khảo
Hợp chất VL1 phân lập được dưới dạng chất bột vơ định hình, màu trắng.
Cơng thức phân tử của VL1 được xác định là C20H30O4 dựa vào kết quả phở khối
lượng phân giải cao HR-ESI-MS với sự xuất hiện pic ion tại m/z 369,1830 [M+Cl]‒
(tính tốn lý thuyết cho cơng thức [C20H30O4Cl]‒, 369,1838).
Trên phở 1H-NMR của hợp chất VL1 (đo trong CD3OD) xuất hiện tín hiệu của
ba nhĩm methyl liên kết trực tiếp với carbon bậc bốn tại δH 0,74 (3H, s), 0,86 (3H, s) và 0,92 (3H, s), hai proton hydroxymethine tại δH 4,38 (t, J = 3,0 Hz) và 4,58 (dd, J = 4,0, 8,0 Hz), ba proton olefin tại δH 4,65 (s), 5,13 (s) và 6,01 (d, J = 2,0 Hz). Trên phở 13C-NMR và DEPT của VL1 xuất hiện tín hiệu của 20 nguyên tử carbon, trong
đĩ cĩ ba carbon methyl tại δC 14,3, 22,0 và 33,8, bảy methylene tại δC 20,4, 32,0, 32,5, 39,8, 43,3, 67,2 và 110,0, năm methine tại δC 47,6, 48,8, 67,2, 74,7 và 114,4, bốn carbon khơng liên kết trực tiếp với hydro tại δC 34,1, 40,5, 150,6 và 177,5 và một carbon carbonyl tại δC 176,5. Tất cả các dữ liệu phở trên gợi ý cấu trúc của VL1 là một diterpene khung labdane [42]. Thêm vào đĩ, số liệu phở NMR của VL1 tương tự với hợp chất vitexolide E (VL1a), được phân lập từ V. vestita [42], ngoại trừ việc xuất hiện thêm nhĩm hydroxy tại C-7. Vị trí của nhĩm hydroxy tại C-7 và liên kết đơi tại C-8/C-17 được xác định dựa trên các tương tác HMBC từ H-17 (δH 4,65 và 5,13) đến C-7 (δC 74,7)/C-8 (δC 150,6)/C-9 (δC 47,6); từ H-7 (δH 4,38) đến C-5 (δC 48,8)/C-6 (δC 32,5)/C9 (δC 47,6). Trên phở 1H-NMR của VL1, hằng số tương tác của H-6 và H-7 nhỏ, J = 3,0 Hz [H-7: δH 4,38 (t, J = 3,0 Hz)], gợi ý cấu hình của nhĩm hydroxy tại C-7 là axial (α). Điều này được khẳng định thêm dựa trên sự so sánh với hằng số tương tác của H-6 và H-7 của hợp chất cĩ nhĩm 7β-hydroxy, J = 11,5 Hz
[7β-hydroxyisocupressic acid: δH 3,83 (1H, dd, J = 5,0, 11,5 Hz), H-7, đo trong
CD3OD)] [120] và hợp chất cĩ nhĩm 7α-hydroxy, J 0 Hz [7α-hydroxylabd-8(17)- en-15,18-dioic acid-15-methyl ester: δH 4,38 (br s), H-7, đo trong CDCl3] [121].
Hình 3.4. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất VL1
Các tương tác HMBC giữa H-14 (δH 6,01) và C-12 (δC 67,2)/C-13 (δC 177,5)/C-15 (δC 176,5)/C-16 (δC 73,0); giữa H-16 (δH 5,01) và C-14 (δC 114,4)/C-15 (δC 176,5); giữa H-12 (δH 4,58) và C-9 (δC 47,6)/C-11 (δC 32,0)/C-13 (δC 177,5)/C- 14 (δC 114,4)/C-16 (δC 73,0) khẳng định sự cĩ mặt của vịng γ-lactone chưa bão hịa tại carbon β (C-13) và vị trí nhĩm hydroxy tại C-12. Bằng so sánh độ bội của H-12 (δH 4,58, dd, J = 4,0, 8,0 Hz) của VL1 với các hợp chất cĩ nhĩm 12α-hydroxy
[vitexolide A: δH 4,56 (br d, J = 10,6 Hz, H-12), đo trong acetone-d6] [42] và hợp chất cĩ nhĩm 12β-hydroxy [12-epivitexolide A: δH (4,61 br s, H-12), đo trong acetone-d6] [42], đã gợi ý nhĩm hydroxy tại C-12 cĩ cấu hình α.
Bảng 3.1. Số liệu phở NMR của hợp chất VL1 và hợp chất tham khảo
C δC δCa,b DEPT δHa,c (J = Hz)
1 39,7 39,8 CH2 1,19 (ddd, 3,0, 12,5, 13,0, α)/1,74 (m, β) 2 20,1 20,4 CH2 1,54 (m, α)/1,64 (m, β) 3 43,0 43,3 CH2 1,30 (m, α)/1,45 (brd, 13,0, β) 4 34,3 34,1 C - 5 56,4 48,8 CH 1,75 (m) 6 25,3 32,5 CH2 1,60 (m, α)/1,91 (ddd, 2,5, 3,0, 14,0, β) 7 39,0 74,7 CH 4,38 (t, 3,0) 8 149,5 150,6 C - 9 52,8 47,6 CH 2,60 (dd, 4,0, 9,0) 10 40,1 40,5 C - 11 32,1 32,0 CH2 1,76 (m) 12 67,3 67,2 CH 4,58 (dd, 4,0, 8,0) 13 176,3 177,5 C - 14 114,2 114,4 CH 6,01 (d, 2,0) 15 174,1 176,5 C - 16 71,8 73,0 CH2 5,01 (m) 17 107,1 110,0 CH2 4,65 (s)/5,13 (s) 18 22,1 33,8 CH3 0,92 (s) 19 34,0 22,0 CH3 0,86 (s) 20 15,2 14,3 CH3 0,74 (s)
#C của vitexolide E (VL1a, đo trong acetone-d6) [42], ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz.
Để xác định chính xác cấu hình tuyệt đối của C-12, hợp chất VL1 được tiến
hành đo phở CD. Phở CD thực nghiệm của hợp chất này được so sánh với các tính tốn theo lí thuyết (phương pháp TDDFT) [122] của hai epimer 1a (7α,12α-
dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide) và 1b (7α,12β-dihydroxylabda-8(17),13- dien-15,16-olide)-cấu trúc chỉ khác nhau ở cấu hình của nhĩm hydroxy tại C-12. Kết quả cho thấy, phở CD của VL1 cĩ hiệu ứng Cotton dương tại max = 218 nm khi đo ở bước sĩng 200-244 nm (nồng độ 10-4 M), và hiệu ứng Cotton âm tại max = 251 nm
khi đo ở bước sĩng 245-280 nm (nồng độ 10-2 M). So sánh với phở CD của hợp chất
1a (cĩ hiệu ứng Cotton dương tại max = 221 nm và hiệu ứng Cotton âm tại max =