1. Tổng quan
1.5.5.2Quan sát kết quả LAMP bằng mắt thường
Ngoài phương pháp điện di trên gel agarose, kết quả dương tính của phản ứng LAMP có thể nhận thấy bằng mắt thường thông qua sự chuyển màu của sản phẩm nhờ vào các các chất chỉ thị màu thích hợp.
Quan sát độ đục sản phẩm
Kết quả của phản ứng LAMP có thể quan sát thông qua độ đục của hỗn hợp phản ứng. Một đặc điểm phương pháp LAMP tổng hợp một lượng lớn DNA, tương ứng đó lượng lớn sản phẩm phụ ion pyrophosphate giải phóng từ dNTP. Phản ứng xảy ra giữa ion magnesium trong phản ứng LAMP với ion pyrophosphate hình thành độ đục trong sản phẩm (hình 1.10) [66] :
(DNA)n-1 + dNTP = (DNA)n + [P2O7]4- [P2O7]4- + 2Mg2+ = Mg2P2O7
(Notomi và cộng sự, 2005)
Hình 1.10: Độ đục sản phẩm khuếch đại của phản ứng LAMP
Quan sát màu huỳnh quang của sản phẩm
Sản phẩm khuếch đại có thể quan sát tốt hơn bằng mắt thường khi có sự hiện diện chất phát huỳnh quang: ethidium bromide, SYBR Green I, Pico green, Calcein...
Calcein là chất chỉ thị kim loại (metal indicator) phát huỳnh quang mạnh khi tương tác với ion kim loại hóa trị II. Tomita cùng cộng sự tiến hành thí nghiệm cho calcein vào hỗn hợp phản ứng LAMP, tuy nhiên không quan sát thấy sự chuyển màu của phản ứng nguyên nhân do ion Mg2+
kết hợp ion pyrophosphate hình thành dạng muối không tan nên nồng độ của ion Mg2+
giảm do đó làm giảm sự tương tác giữa Mg2+ với calcein . Sau đó tác giả bổ sung thêm ion Mn2+ và quan sát nhận thấy có sự đổi màu hỗn hợp phản ứng [96].
Hình 1.11: Quá trình phát hiện sản phẩm khuếch đại sử dụng chất chỉ thị huỳnh quang kim loại (calcein). Sản phẩm phụ ion pyrophosphate được hình thành từ cơ chất deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs). Giai đoạn đầu Calcein kết hợp với Mn2+ trong phản ứng, sau khi quá trình khuếch đại diễn ra,
Mn2+ tách khỏi calcein và kết hợp với ion P2O7. Sau đó các calcein tự do sẽ kết hợp với ion Mg2+
trong phản ứng và phát huỳnh quang.
Ethidium bromide, SYBR Green I, Pico Green … là những chất chèn vào DNA mạch đôi và phát huỳnh quang [27], [98].
Hình 1.12: Pico green đổi màu khi có sự hình thành sản phẩm trong phản ứng
LAMP (màu vàng: dương tính, màu cam: âm tính).