2. Vật liệu và phương pháp
2.2.2Tách chiết DNA vi khuẩn gram dương từ mẫu máu toàn phần dựa theo
theo quy trình DNeasy Blood and Tissue Kit
Nguyên tắc chung
Quy trình tách chiết nucleic acid ứng dụng hoạt tính biến tính của các hoạt chất chaotropic (các chất có hoạt tính biến tính cực mạnh, có khả năng phá vỡ liên kết không gian của các đại phân tử như DNA, RNA, protein…) và silica matrix. Các muối chaotropic thường được dùng là guanidine isothiocynate (GuSCN), sodium iodide (NaI) và lithium chloride (LiCl) có khả năng phân giải các vỏ nang giàu lipid của vi khuẩn và các lớp bao ngoài của tế bào, ngoài ra còn có thể biến tính protein và bất hoạt các nuclease. GuSCN ở nồng độ mol cao (>4M) có khả năng ngưng kết DNA, RNA phân tử lượng cao và cũng có thể ngưng kết mRNA ở các nồng độ cao hơn nữa. Trong môi trường giàu muối chaotropic, các hợp chất silica có khả năng gắn chuyên biệt với các phân tử DNA và RNA, trong khi đó các lipid và protein tạp nhiễm có ái lực rất thấp với silica và có thể bị rửa đi dễ dàng. Hoặc bằng cách biến đổi bản chất hóa học của silica matrix, lớp matrix này lại có thể gắn đặc hiệu với các protein tạp nhiễm hoặc polysaccharide thực vật thay vì nucleic acid. Sự tương tác nucleic acid và silica matrix được tăng cường trong môi trường pH thấp và nồng độ muối cao, do đó khi sử dụng dung dịch buffer có pH cao và nồng độ muối thấp ta có thể tách (elute) nucleic acid ra khỏi silica matrix. Các bước lọc, ly tâm cho phép ta tách nucleic acid bám vào silica khỏi lipid, carbohydrate và protein tạp nhiễm thông qua các bước rửa liên tục. Quy trình này giúp tách chiết nucleic acid ra khỏi các loại mẫu phức tạp như phân, tinh dịch hoặc huyết tương một cách dễ dàng. Một điểm bất lợi trong phương pháp tách chiết dùng silica matrix là khi ta tiến hành các bước gắn và tách liên tục, nucleic acid bị đứt gãy dẫn đến sự phân mảnh DNA và nhiều khả năng làm mất đoạn DNA mục tiêu.
Quy trình
1. Ly giải tế bào
- Hút 100 μl Protease QIAGEn cho vào tube quy ly tâm 15 ml. - Thêm 0,75 ml PBS và 0,25 ml máu toàn phần, trộn đều.
- Thêm 1,2 ml Buffer AL, trộn đều bằng cách đảo ngược 15 lần. - Ủ 70oC trong 10 phút.
2. Kết tủa protein
- Thêm 500 μl Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol vào mẫu, trộn đều bằng cách đảo ngược khoảng 10 lần.
- Quay ly tâm 4000 vòng trong 20 phút.
- Chuyển toàn bộ dịch nổi vào tube quay ly tâm 15 ml. 3. Kết tủa DNA
- Thêm 1 ml ethanol (96-100%) cho vào mẫu, trộn đều bằng cách đảo ngược 10 lần.
- Chuyển một nửa hay toàn bộ dung dịch vào DNeasy Mini Spin Column đặt vào trong tube 2ml, cẩn thận không làm ướt vành nắp. Đóng nắp lại và quay ly tâm ở 8000 vòng trong 1 phút.
- Loại bỏ dịch lọc, chuyển DNeasy Mini Spin Column vào tube mới 2 ml. 4. Rửa
- Thêm 600 μl Buffer AW1 vào DNeasy Mini Spin Column. Đóng nắp và quay ly tâm 8000 vòng trong 1 phút.
- Tiếp tục thêm 600 μl Buffer AW2 vào DNeasy Mini Spin Column. Đóng nắp lại và quay ly tâm 14000 vòng trong 3 phút.
- Đặt DNeasy Mini Spin Column vào một tube 2 ml sạch, loại bỏ phần dịch lọc. Quay ly tâm 14000 vòng trong 3 phút.
- Hút 200 μl Buffer AE hoặc nước vô trùng cho vào DNeasy Mini Spin Column và đóng nắp lại. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó quay ly tâm 10.000 vòng trong 2 phút.