2. Vật liệu và phương pháp
3.1Xác định độ đặc hiệu của mồi cpn60 bằng phản ứng PCR
Khảo sát độ đặc hiệu mồi trong phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 33 serotype S. suis (serotype 1 – 34, ngoại trừ serotype ½ và 8) và 9
chủng vi khuẩn khác Klebsiella, E.coli ATCC 25922, Acinetobacteria, Pseudomonas, Salmonella, Streptococcus pneumonia ATCC 33400 (S.pneumonia), Methicillin-resistance staphylococcus aureus (MRSA), Methicillin-
susceptibleStaphylococcus aureus (MSSA), Pasteurella multocida (phụ lục 1).
Hình 3.1: Độ đặc hiệu mồi của phản ứng PCR. Giếng 1-11 (Klebsiella, E.coli,
Acinetobacteria, Pseudomonas, Salmonella, S.pneumonia, MRSA, MSSA, Pasteurella multocida, S. suis serotype 32, S. suis serotype 34).
300 bp 270 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 P N M
Bảng 2.4: Thành phần hóa chất trong phản ứng LAMP
Tiến hành phản ứng theo chương trình sau: Bước 1: 61oC/ 80 phút
Bước 2: 80oC/ 5 phút. Phân tích sản phẩm
Sản phẩm khuếch đại nhìn thấy bằng mắt thường sau khi cho thêm 2 μl Pico Green (Invitrogen) vào hỗn hợp, quan sát sự đổi màu của phản ứng. Nếu có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại thì phản ứng có màu vàng, ngược lại hổn hợp có màu cam. Hơn nữa sản phẩm khuếch đại điện di trên gel agarose 1,5% ở 150V trong vòng 45 phút, sau đó quan sát dưới tia UV sản phẩm hình thành là vạch smear kéo dài.
Tác chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích (μl/phản ứng) Thermopol buffer 10X 1X 2,5 MgSO4 100 mM 6 mM 1,25 dNTPs 10 mM 0,9 mM 2,25 Betaine 5M 0,8 mM 4 Primer FIP 20 μM 1,6 μM 2 BIP 20 μM 1,6 μM 2 F3 20 μM 0,2 μM 0,25 B3 20 μM 0,2 μM 0,25 Bst DNA polymerase 8000 U 8U 1 Nước / / 4,25 DNA khuôn / / 5 Tổng 25
2.2.6 Tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng
Nhiệt độ phản ứng: Phản ứng LAMP được thực hiện ở 60oC, 61oC, 62oC, 63oC, 64oC, 65oC.
Nồng độ Betaine: Phản ứng LAMP được thực hiện các nồng độ Betaine khác nhau 0,4 M; 0,6M ; 0,8M. Dựa vào quan sát màu sắc và điện di, hiệu quả phản ứng LAMP ở nồng độ betaine trên được đánh giá và đưa ra nồng độ betaine tối ưu cho phản ứng LAMP.
Nồng độ dNTPs: Nồng độ dNTPs được khảo sát ở 0,8 mM; 0,9mM; 1,0 mM.
Thời gian phản ứng: Thời gian phản ứng với 60, 70, 80, 90, 100, 110 phút được chuẩn hóa.
Khảo sát độ đặc hiệu của Pico Green: Để đánh giá xem chất nhuộm Pico Green có xảy ra tình trạng dương tính giả trong phản ứng LAMP. Quá trình kiểm tra được thực hiện với 1 mẫu chứng dương , 1 thành phần hổn hợp của phản ứng LAMP nhưng để ở nhiệt độ phòng, 1 mẫu chứng âm, 25μl S. suis serotype 2 (107cfu/ml).
2.2.7 Khảo sát độ đặc hiệu của mồi trong phản ứng PCR và LAMP
Đánh giá độ đặc hiệu của mồi trong phản ứng PCR và LAMP, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với DNA của 33 serotype S. suis và 9 chủng vi khuẩn khác :
Klebsiella, E.coli ATCC 25922, Acinetobacter, Pseudomonas, Salmonella, Streptococcus pneumonia ATCC 33400, Methicillin-resistance Staphylococcus aureus (MRSA), Pasteurella multocida, Methicillin-susceptible Staphylococcus
2.2.8 So sánh độ nhạy giữa phương pháp LAMP và phương pháp nuôi cấy. cấy.
Nguyên tắc:
Ngày nay có rất nhiều phương pháp phát hiện tác nhân gây bệnh, nuôi cấy là “tiêu chuẩn vàng” so với các phương pháp khác. Tuy nhiên, dưới sự tác động của kháng sinh đối với vi khuẩn có thể dẫn đến hiệu suất nuôi cấy thấp. Ceftriaxone là một kháng sinh dòng cephalosporin thế hệ thứ ba, nhóm bêta- lactam, có khả năng kháng khuẩn mạnh với phổ rộng nên được dùng trong điều trị các loại nhiễm trùng nặng. Ceftriaxone giết chết vi khuẩn do việc ức chế việc tổng hợp thành tế bào.
Vì thế, chúng tôi tiến hành so sánh việc phát hiện tác nhân gây bệnh giữa phương pháp nuôi cấy và LAMP trong trường hợp sử dụng kháng sinh.
Mục tiêu:
So sánh độ nhạy giữa phương pháp LAMP và nuôi cấy trong trường hợp mẫu sử dụng kháng sinh.
Vật liệu:
Chủng S. suis CM 368 với kiểu hình CRO-SS (S. suis nhạy với kháng sinh ceftriaxone) với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC = 0,2 μg/ml).
2xMIC 4xMIC
8xMIC Qui trình thí nghiệm: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sơ đồ 2.2: So sánh độ nhạy giữa phương pháp nuôi cấy và LAMP
37oC/ 5% CO2/24h 4-6 h 80 μl + 900 μl máu (ủ 24h)
Chủng thuần S. suis CM 368 được cấy trên môi trường BA ủ 24h ở 37oC/ 5% CO2. Chọn một khúm khuẩn chuyển vào môi trường THB (không có kháng sinh) ủ 4-6 h ở 37oC. Dịch nuôi cấy đo OD ở bước sóng 600 nm ( A600 = 1 tương đương 108 CFU/ml). Sau đó quay ly tâm đổ bỏ dịch nổi, tiếp theo bổ sung thêm 1
Chủng CM 368 Thạch máu THB (không có kháng sinh) Đo OD Pha loãng bậc 10 (106 ,105, 104 ,103 cfu/ml)
LAMP NUÔI CẤY
Ceftriaxone Quay ly tâm
900 μl máu cừu) thu được các nồng độ 106 ,105, 104 ,103 cfu/ml. Sau đó bổ sung 20 μl kháng sinh ceftriaxone có các nồng độ pha loãng tương ứng 2, 4, 8 lần MIC và ủ 24h. Sau mỗi khoảng thời gian ủ tiến hành định lượng vi khuẩn bằng phương pháp cấy trải theo bậc pha loãng trên thạch máu cừu. Song song đó các bậc pha loãng này tiến hành chạy LAMP. So sánh ngưỡng phát hiện giữa phương pháp LAMP và nuôi cấy.
Hình 3.2 : Độ đặc hiệu mồi của phản ứng PCR. Giếng 1-17 (S. suis
serotype 1-18), giếng 20-35 (S. suis serotype 19-34), giếng P (chứng dương), giếng N (chứng âm), giếng M (thang 100bp).
Mồi thiết kế dựa vào gen cpn60 của S.suis không cho sản phẩm với DNA
của các chủng vi khuẩn khác trong phản ứng PCR (hình 3.1) và hình thành sản phẩm khuếch đại đặc hiệu với kích thước 270 bp đối với các serotype của S. suis (hình 3.2). Các kết quả trên khẳng định cặp mồi sử dụng có tính đặc hiệu cao trong quá trình phát hiện S. suis dựa trên trình tự gen cpn60. Dựa vào kết quả này, chúng tôi tiến hành thiết kế mồi để phát hiện S. suis bằng phương pháp LAMP dựa
300 bp 270 bp 300 bp 270 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 P N M 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 P N M