2. Vật liệu và phương pháp
3.2.2 Khảo sát độ đặc hiệu của Pico Green
Để khảo sát xem có sự xuất hiện tình trạng dương tính giả khi sử dụng chất chỉ thị Pico green trong phản ứng LAMP. Chúng tôi bố trí 4 phản ứng gồm: chứng dương (chứa DNA S. suis), chứng âm, thành phần hỗn hợp giống chứng dương
không thực hiện chạy LAMP (để ở nhiệt độ phòng) và một phản ứng chỉ chứa 25 µl DNA S. suis với nồng độ cao (107 cfu/ml).
Kết quả nhận thấy chỉ có chứng dương làm đổi màu Pico green (màu cam thành màu vàng) (tube 1, hình 3.4 A). Đối với trường hợp chứng âm và hỗn hợp để ở nhiệt độ phòng không làm đổi màu Pico green (tube 2, 3-hình 3.4 A). Ngoài ra, thành phần chỉ chứa DNA S. suis nồng độ cao (107 cfu/ml) sau khi cho Pico Green vào hình thành màu cam (tube 4, hình 3.4 A).
Sau đó, chúng tôi tiến hành chạy điện di nhằm khẳng định thêm tính hiệu quả của Picogreen. Kết quả chứng minh rằng vạch sản phẩm chỉ hình thành trong trường hợp có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại trong phản ứng LAMP (giếng 1,
hình 3.4 B). Các trường hợp còn lại không có sự hình thành sản phẩm (giếng 2,3,4, hình 3.4 B). Điều này kết luận rằng Pico green có tính đặc hiệu cao, không
hình thành phản ứng dương tính giả trong phản ứng LAMP.
Vì thế, chúng tôi đã chọn Pico green để làm chất chỉ thị cho phản ứng LAMP.
Hình 3.4: Độ đặc hiệu Pico Green . (A), (B): Giếng 1, tube 1 (chứng dương); giếng 2, tube 2 (chứng âm); giếng 3, tube 3(thành phần hỗn hợp để ở nhiệt độ phòng); giếng 4, tube 4 (25μl DNA S. suis serotype 2).
3.2.3 Tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng 3.2.3.1 Nhiệt độ phản ứng 3.2.3.1 Nhiệt độ phản ứng
Chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm trong khoảng 60oC – 65oC vì đây là khoảng dao động nhiệt độ thích hợp để enzyme Bst polymerase hoạt động trong phản ứng LAMP [72]. Theo kết quả điện di ở 65oC không hình thành sản phẩm khuếch đại (giếng 6, hình 3.5). Trong khi đó, ở 60oC, 61oC 62oC, 63oC, 64oC có sự hình thành sản phẩm và các vạch sản phẩm sáng và rõ ràng nhất ở 61oC (giếng
2, hình 3.5) so với các nhiệt độ còn lại. Qua đó kết luận rằng nhiệt độ có ảnh
hưởng đến quá trình khuếch đại DNA của phản ứng LAMP và 61oC là nhiệt độ tối ưu trong phản ứng LAMP phát hiện S. suis.
(A) (B)
Hình 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ. Giếng 1-6 (60o
C, 61oC, 62oC, 63oC, 64oC, 65oC), giếng 7: chứng âm, giếng M: thang 100bp.
3.2.3.2 Nồng độ Betaine
Sản phẩm khuếch đại thu được tương ứng với các nồng độ betaine 0,4 M; 0,6 M; 0,8 M được khảo sát trong phản ứng LAMP đều làm thay đổi màu Pico green (màu vàng). Tuy nhiên khi chạy điện di nhận thấy các ở nồng độ betaine 0,4 M vạch sản phẩm mờ hơn so với nồng độ betaine 0,6 M và 0,8 M (hình 3.6) và giữa 2 nồng độ 0,6 M và 0,8 M không có sự khác biệt. Điều này có thể kết luận rằng nồng độ betaine tối ưu trong phản ứng LAMP khi phát hiện S. suis 0,6 M hay 0,8 M. Để cân bằng nồng độ betaine sao cho đủ để phản ứng xảy ra và không lãng phí, nồng độ betaine 0,6 M được chọn để sử dụng cho các phản ứng LAMP sau này.
Hình 3.6: Ảnh hưởng nồng độ Betaine. Giếng 1 - 3 (0,4; 0,6; 0,8 M), giếng 4:
chứng âm, giếng 5: chứng dương, giếng M: thang 100 bp)
3.2.3.3 Nồng độ dNTPs
Các nồng độ dNTPs 0,8; 0,9; 1,0 mM làm đổi màu Pico green (màu vàng). Kết quả điện di nhận thấy ở nồng độ dNTPs 0,8 mM thu được các vạch sản phẩm mờ hơn so với nồng độ 0,9 mM và 1,0 mM. Nguyên nhân có thể do sự thiếu nhiên liệu (dNTP) cần thiết cho quá trình tổng hợp polymerase. Sản phẩm chỉ thực sự khuếch đại mạnh mẽ ở nồng độ 0,9 và 1,0 mM (hình 3.7). Do đó, nồng độ dNTPs 0,9 mM là nồng độ tối ưu được sử dụng trong phản ứng LAMP khi phát hiện
S. suis.
1 2 3 4 5 M
0,8mM 0,9mM 1,0mM
Hình 3.7: Ảnh hưởng nồng độ dNTPs. Giếng 1 (0,8 mM), giếng 3 (0,9 mM),
giếng 5 (1,0 mM), giếng 2, 4, 6: chứng âm; giếng M: thang 100 bp.
3.2.3.4 Thời gian phản ứng
Phản ứng LAMP thực hiện ở 60 phút không làm đổi màu Pico green ( vẫn là màu cam). Ở 70, 80, 90, 100, 110 phút cho kết quả dương tính với Pico green (màu vàng). Kết quả điện di nhận thấy rằng sản phẩm khuếch đại không hình thành ở thời điểm 60 phút. Khi tăng thời gian lên 70 phút có xuất hiện sản phẩm khuếch đại nhưng các vạch hơi mờ. Tuy nhiên, sản phẩm thực sự khuếch đại mạnh mẽ ở 80, 90, 100, 110 phút và không có sự khác biệt lớn giữa các thời điểm này (hình 3.8). Do đó, để vừa thu được sản phẩm khuếch đại tối đa và vừa tiết kiệm thời gian thực hiện phản ứng, chúng tôi chọn thời gian tối ưu cho phản ứng LAMP là 80 phút.
Hình 3.8: Ảnh hưởng thời gian phản ứng: giếng 1-3 (60, 70, 80 phút), giếng 7-9
(90, 100, 110 phút), giếng M: thang 100 bp
3.2.3.5 Khảo sát độ đặc hiệu của mồi trong phản ứng LAMP
Để khảo sát độ đặc hiệu của mồi trong phản ứng LAMP nhằm phát hiện
S. suis, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với DNA của 33 serotype S. suis và 10
chủng vi khuẩn khác (phụ lục 1).
Mồi trong phản ứng LAMP không bắt cặp với trình tự gen cpn60 của các
chủng Klebsiella, E.coli ATCC 25922, Acinetobacter, Pseudomonas, Salmonella,
S.pneumonia ATCC 33400, MRSA, MSSA, Pasteurella multocida, Enterococcus faecium (giếng 1-9, hình 3.9).
Hình 3.9: Độ đặc hiệu mồi của phản ứng LAMP. Giếng 1-12 (Klebsiella, E.coli,
Acinetobacter, Pseudomonas, Salmonella, S.pneumonia, MRSA, MSSA, Pasteurella multocida, Enterococcus faecium, S.suis serotype 32, S. suis serotype
34), giếng 13 (chứng dương ), giếng 14 (chứng âm), giếng M (thang 100 bp). Sau khi tiến hành khảo sát độ đặc hiệu của mồi LAMP với các chủng vi khuẩn không thuộc S. suis, chúng tôi tiếp tục thử nghiệm đối với 33 serotype S. suis. Kết quả điện di chứng minh rằng có sự bắt cặp và hình thành sản phẩm
khuếch đại với hầu hết tất cả các serotype của S. suis ngoại trừ S. suis serotype 27 (giếng 28 - hình 3.10), 29 (giếng 30- hình 3.10) và 34 (giếng 12- hình 3.9 và giếng 35- hình 3.10).
Hình 3.10: Độ đặc hiệu mồi của phản ứng LAMP. Giếng 1-17 (S. suis serotype
1-18), giếng 20-35 (S.suis serotype 19-34), giếng P (chứng dương), giếng N (chứng âm), giếng M (thang 100bp).
Theo như đã đề cập ở trên (đề mục 1.1.3, trang 2), S. suis serotype 27 và 29 không thuộc trong danh sách các chủng thường gây bệnh cho heo và cũng chưa bao giờ xác định là chủng gây bệnh cho người. Do đó chúng tôi cho rằng việc không phát hiện serotype 27 và 29 không ảnh hưởng nghiêm trọng trong chẩn đoán phát hiện S. suis gây bệnh trên người và heo. Vì thế. Chúng tôi vẫn khẳng
định tính hiệu quả và đặc hiệu cao của các mồi phản ứng LAMP trong ứng dụng chẩn đoán.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 P N M
Mặc khác, khảo sát trình tự DNA của gen cpn60 khi sắp giống cột so sánh các trình tự tham khảo trong quá trình thiết kế mồi cho thấy trình tự cpn60 của
serotype 27 và 29 chỉ khác một hoặc hai nucleotide so với trình tự của mồi. Điều này được chúng tôi dự đoán rằng serotype 27 và 29 có thể phát hiện bằng các mồi đã thiết kế trong phương pháp LAMP. Việc không phát hiện được serotype 27 và 29 trong phản ứng LAMP là kết quả ngoài dự kiến và có thể lý giải: do các chủng (phân lập từ heo bệnh ở Thành phố Hồ Chí Minh) chúng tôi sử dụng có thể có trình tự gen cpn60 khác hoặc có thể xuất hiện nhiều SNP (single nucleotide
polymorphisms) so với chủng tham khảo (chủng Canada).
3.3 So sánh ngưỡng phát hiện giữa phương pháp LAMP và nuôi cấy
3.3.1 Khảo sát nồng độ kháng sinh ceftriaxone có thể gây chết S.suis CM368 CM368
Phương pháp nuôi cấy phân lập vi sinh truyền thống vẫn được xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán. Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy có thể gặp thất bại nếu bệnh nhân hay heo bệnh đã dùng kháng sinh điều trị trước khi lấy mẫu chẩn đoán. Nhằm đánh giá khả năng phát hiện S. suis bằng phương pháp LAMP với
phương pháp nuôi cấy, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng phát hiện S. suis
trong dịch nuôi cấy có chứa kháng sinh. Vì thế, chúng tôi bố trí thí nghiệm nhằm phát hiện vi khuẩn S.suis trong môi trường có bổ sung hàm lượng kháng sinh
Hình 3.11: S. suis CM 368 mọc trên môi trường thạch máu sau khi ủ với
ceftriaxone với nồng độ 2xMIC (0.4 μg/ml) ở 24h.
1,46x106 cfu/ml 1,46x105 cfu/ml
Hình 3.12: S. suis CM 368 mọc trên môi trường thạch máu sau khi ủ với
ceftriaxone với nồng độ 4xMIC (0.8 μg/ml) ở 24h.
1,46x106 cfu/ml 1,46x105 cfu/ml
Bảng 3.1: Nồng độ S. suis sau khi ủ với ceftriaxone (2xMIC và 4xMIC) ở thời
điểm 24h
Số lượng vi khuẩn S. suis ủ với ceftriaxone với nồng độ 2xMIC giảm ít ở thời điểm 24h so với nồng độ vi khuẩn ban đầu (hình 3.11), (bảng 3.1). Kết quả cho thấy nồng độ ceftriaxone 2xMIC không thể tiêu diệt hoàn toàn vi khuẩn. Tuy nhiên khi ủ vi khuẩn với nồng độ kháng sinh ceftriaxone 4xMIC kết quả thu được số lượng vi khuẩn giảm đáng kể (hình 3.12), (bảng 3.1). Kết quả cho thấy với nồng độ 1,46x103 cfu/ml lúc 24h thì không có bất kỳ khuẩn lạc nào mọc trên môi trường thạch máu. Điều này có thể kết luận ceftriaxone với nồng độ 4xMIC có thể tiêu diệt được vi khuẩn nồng độ thấp (103 cfu/ml) nhưng ở nồng độ vi khuẩn cao (1,46x106 cfu/ml) mật độ vi khuẩn giảm ít sau khi ủ với kháng sinh. Theo các nghiên cứu trước đây, mật độ vi khuẩn S. suis ở nồng độ cao là nguyên nhân chính gây chết ký chủ, chẳng hạn S. suis gây chết 30% chuột với liều gây nhiễm 5x107
cfu/ml [68] và 106 cfu/ml [53] là liều chết đối với heo con.
Tuy nhiên trong kết quả thí nghiệm của chúng tôi cho thấy với nồng độ ceftriaxone 2xMIC và 4xMIC vi khuẩn ở nồng độ cao không bị tiêu diệt hoàn toàn. Thực tế bệnh nhân nghi ngờ nhiễm S. suis được điều trị bằng ceftriaxone với nồng độ 1g/ người lớn ( tiêm tĩnh mạch 1g/10 ml nước cất hay tiêm bắp 1g ceftriaxone pha loãng 3,5ml dung dịch 1% lignocaine hydrochloride BP) [26].
Nồng độ vi khuẩn ban đầu Nồng độ vi khuẩn ủ với 2xMIC Nồng độ vi khuẩn ủ với 4xMIC cfu/ml 1,46x106 9,65x105 8,25x105 1,46x105 8,67x104 180 1,46x104 7,34x103 10 1,46x103 780 0
1,47x104 cfu/ml 1,47x103 cfu/ml
Vì thế chúng tôi tăng nồng độ ceftriaxone lên 8xMIC (1,6 μg/ml tương đương với 6,4 mg/ 4l ~ lượng máu trong cơ thể người lớn) trong phản ứng nuôi cấy S. suis.
Sau đó, chúng tôi tiến hành khảo sát sự tác động ceftriaxone nồng độ 8xMIC lần lượt với các nồng độ S. suis 1,47x106; 1,47x105 ; 1,47x104 ; 1,47x103 cfu/ml đến thời điểm 24h. Kết quả cho thấy rằng với nồng độ 1,47x106
cfu/ml mật độ
S. suis chỉ giảm ít khi tiếp xúc với kháng sinh, tuy nhiên trong các nồng độ còn lại 1,47x105; 1,47x104 ; 1,47x103 cfu/ml, kết quả nuôi cấy cho thấy không có khúm khuẩn lạc nào mọc trên thạch máu sau 24h ủ (hình 3.13), (bảng 3.2), điều này có nghĩa là với các nồng độ vi khuẩn này bị tiêu diệt hoàn toàn bởi kháng sinh ceftriaxone nồng độ 8xMIC.
Hình 3.13: S. suis CM 368 mọc trên môi trường thạch máu sau khi ủ với
Bảng 3.2: Nồng độ S. suis giảm sau khi ủ với ceftriaxone 8xMIC ở thời điểm 24h
Tóm lại, S. suis không bị tiêu diệt khi ủ với nồng độ ceftriaxone 2xMIC và
4xMIC có khả năng giết chết S. suis nồng độ thấp. Tuy nhiên, với nồng độ 8xMIC, ceftriaxone tác động và giết chết S. suis hoàn toàn ở nồng độ cao đến 105 cfu/ml.
3.3.2 Xác định đường cong chết phụ thuộc thời gian (time kill-curve) của chủng S. suis CM 368 trong môi trường có cetriaxone nồng độ 8xMIC của chủng S. suis CM 368 trong môi trường có cetriaxone nồng độ 8xMIC
Song song với quá trình khảo sát nồng độ ceftriaxone 8xMIC có thể tiêu diệt S. suis, chúng tôi tiến hành xác định đường cong chết phụ thuộc thời gian
(time kill – curve) của S. suis khi tiếp xúc với kháng sinh ceftriaxone 8xMIC. Thí nghiệm này nhằm mục đích đánh giá nồng độ vi khuẩn giảm tương ứng với các thời điểm khác nhau khi tiếp xúc với kháng sinh và xác định khoảng thời gian vi khuẩn S. suis không mọc trên thạch đĩa.
Chúng tôi chọn S.suis với nồng độ 1,47x105 cfu/ml ủ với ceftriaxone 8xMIC sau các khoảng thời gian: 1h, 2h, 4h, 8h, 16h, 24h.
Nồng độ S. suis CM 368 lúc ban đầu (0h) là 1,47x105 cfu/ml sau khi tiếp xúc với ceftriaxone 8xMIC nhận thấy rằng ở thời điểm 1h nồng độ S. suis bắt đầu giảm (so với mẫu không có kháng sinh – đối chứng). Sau đó mật độ vi khuẩn S. suis tiếp tục giảm mạnh sau các các thời điểm 2h, 4h, 8h, 16h và đến thì không còn
khuẩn lạc nào mọc trên đĩa thạch (tương đương với nồng độ S. suis trong dịch nuôi cấy bằng 0 cfu/ml) (đồ thị 3.1). Do đó, chúng tôi kết luận ceftriaxone với nồng độ 8xMIC (1,6 μg/ml) tiêu diệt S. suis ở nồng độ cao (1,47x105 cfu/ml) sau 24h. Kết
Nồng độ S. suis ban đầu (cfu/ml)
Nồng độ S. suis ủ với 8xMIC (cfu/ml) 1,47x106 4,25x105
1,47x105 0 1,47x104 0 1,47x103 0
quả trên phù hợp với thí nghiệm của Goonetilleke, tác giả và cộng sự chứng minh rằng khi sử dụng 1g ceftriaxone/10ml nước vô trùng trong quá trình điều trị bệnh nhân viêm màng não thì xác định nồng độ đỉnh kháng sinh (Cmax mg/ml) trong huyết thanh đạt được trong 1h điều này có nghĩa là ceftriaxone đạt nồng độ tối đa và mức độ diệt khuẩn trong 1h. Bên cạnh đó tác giả còn chứng minh rằng tác dụng diệt khuẩn của ceftriaxone duy trì trong thời gian 24h [26].
Đồ thị 3.1: Đường cong chết phụ thuộc thời gian của chủng S. suis CM368
nhạy ceftriaxone trong môi trường có ceftriaxone nồng độ 8xMIC. Trục X
biểu thị nồng độ vi khuẩn, trục Y biểu thị thời gian. Control: mẫu đối chứng – là môi trường nuôi cấy S. suis (1,47x105 cfu/ml) không chứa ceftriaxone; CRO: là môi trường nuôi cấy S. suis (1,47x105 cfu/ml) có chứa ceftriaxone nồng độ 8xMIC.
Kết quả trên chứng minh ceftriaxone bắt đầu có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn
S. suis (1,47x105 cfu/ml) ở thời điểm 1h và S. suis không mọc bất kỳ khuẩn lạc
nào trên môi trường thạch máu sau 24h. Điều này chứng tỏ 24h là thời điểm thích hợp chúng tôi tiến hành lấy mẫu nhằm so sánh độ nhạy giữa LAMP và nuôi cấy.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24T (h) L o g C F U /m l CONTROL CRO X8MIC
3.3.3 So sánh ngưỡng phát hiện giữa phương pháp nuôi cấy và LAMP
Từ kết quả trên chúng tôi tiến hành so sánh khả năng phát hiện S. suis trong
mẫu chứa ceftriaxone (nồng độ 8xMIC) bằng phương pháp nuôi cấy và LAMP. Chúng tôi tiến hành khảo sát ngưỡng phát hiện bằng phản ứng LAMP với các nồng độ S. suis khác nhau bao gồm 1,47x106; 1,47x105; 1,47x104 ; 1,47x103 cfu/ml.
Hình 3.14: Ngưỡng phát hiện phương pháp LAMP và sản phẩm được quan sát
bằng điện di: giếng 1-6 (1,47x106; 1,47x105 ; 1,47x104 ; 1,47x103 ; 7x102; 3,5x102 cfu/ml), giếng 7-9 ( 175 ; 70 ; 35 cfu/ml), giếng 10 (chứng dương), giếng 11 chứng âm), giếng M (thang 100bp).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
Bảng 3.3: So sánh ngưỡng phát hiện giữa phương pháp LAMP và nuôi cấy vi
sinh.
Phương pháp Nồng độ ban đầu Nồng độ pha loãng từ 1,47x103
cfu/ml
1,47x106 1,47x105 1,47x104 1,47x103 7x102 3,5x102 175 70
LAMP + + + + + + - -
Nuôi cấy + - - - - - - -
Quan sát sự chuyển màu Pico green và kết quả chạy điện di, LAMP phát hiện
S. suis từ nồng độ 3,5 x102 đến 1,47x106 cfu/ml (hình 3.14, bảng 3.3). Ngưỡng phát hiện bằng phương pháp LAMP được xác định 3,5x102
cfu/ml tương đương 8 cfu/phản ứng. Trong khi đó ngưỡng phát hiện của nuôi cấy trong trường hợp sử dụng ceftriaxone với nồng độ 8xMIC là > 1,47x105 cfu/ml. Kết quả chứng minh phương pháp LAM là 8 cfu/ml và nhạy hơn nuôi cấy trong trường hợp mẫu máu nhiễm S. suis đã sử dụng kháng sinh ceftriaxone (bảng 3.3).
3.4 Thảo luận
S. suis được xác định là tác nhân gây bệnh quan trọng trên heo với khả năng
lây nhiễm trực tiếp sang người theo con đường tiếp xúc trực tiếp hoặc ăn uống và gây thiệt hại kinh tế hằng năm cho ngành công nghiệp chăn nuôi heo vô cùng to lớn. Ít nhất 8% heo khỏe tại Việt Nam mang vi khuẩn S. suis serotype 2 được báo cáo [69]. Thói quen tiêu thụ sản phẩm heo bệnh, dù được khuyến cáo không nên, vẫn được duy trì tại các vùng nông thôn Việt Nam do điều kiện kinh tế và kiến