2. Vật liệu và phương pháp
3.2.3.5Khảo sát độ đặc hiệu của mồi trong phản ứng LAMP
Để khảo sát độ đặc hiệu của mồi trong phản ứng LAMP nhằm phát hiện
S. suis, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với DNA của 33 serotype S. suis và 10
chủng vi khuẩn khác (phụ lục 1).
Mồi trong phản ứng LAMP không bắt cặp với trình tự gen cpn60 của các
chủng Klebsiella, E.coli ATCC 25922, Acinetobacter, Pseudomonas, Salmonella,
S.pneumonia ATCC 33400, MRSA, MSSA, Pasteurella multocida, Enterococcus faecium (giếng 1-9, hình 3.9).
Hình 3.9: Độ đặc hiệu mồi của phản ứng LAMP. Giếng 1-12 (Klebsiella, E.coli,
Acinetobacter, Pseudomonas, Salmonella, S.pneumonia, MRSA, MSSA, Pasteurella multocida, Enterococcus faecium, S.suis serotype 32, S. suis serotype
34), giếng 13 (chứng dương ), giếng 14 (chứng âm), giếng M (thang 100 bp). Sau khi tiến hành khảo sát độ đặc hiệu của mồi LAMP với các chủng vi khuẩn không thuộc S. suis, chúng tôi tiếp tục thử nghiệm đối với 33 serotype S. suis. Kết quả điện di chứng minh rằng có sự bắt cặp và hình thành sản phẩm
khuếch đại với hầu hết tất cả các serotype của S. suis ngoại trừ S. suis serotype 27 (giếng 28 - hình 3.10), 29 (giếng 30- hình 3.10) và 34 (giếng 12- hình 3.9 và giếng 35- hình 3.10).
Hình 3.10: Độ đặc hiệu mồi của phản ứng LAMP. Giếng 1-17 (S. suis serotype
1-18), giếng 20-35 (S.suis serotype 19-34), giếng P (chứng dương), giếng N (chứng âm), giếng M (thang 100bp).
Theo như đã đề cập ở trên (đề mục 1.1.3, trang 2), S. suis serotype 27 và 29 không thuộc trong danh sách các chủng thường gây bệnh cho heo và cũng chưa bao giờ xác định là chủng gây bệnh cho người. Do đó chúng tôi cho rằng việc không phát hiện serotype 27 và 29 không ảnh hưởng nghiêm trọng trong chẩn đoán phát hiện S. suis gây bệnh trên người và heo. Vì thế. Chúng tôi vẫn khẳng
định tính hiệu quả và đặc hiệu cao của các mồi phản ứng LAMP trong ứng dụng chẩn đoán.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 P N M
Mặc khác, khảo sát trình tự DNA của gen cpn60 khi sắp giống cột so sánh các trình tự tham khảo trong quá trình thiết kế mồi cho thấy trình tự cpn60 của
serotype 27 và 29 chỉ khác một hoặc hai nucleotide so với trình tự của mồi. Điều này được chúng tôi dự đoán rằng serotype 27 và 29 có thể phát hiện bằng các mồi đã thiết kế trong phương pháp LAMP. Việc không phát hiện được serotype 27 và 29 trong phản ứng LAMP là kết quả ngoài dự kiến và có thể lý giải: do các chủng (phân lập từ heo bệnh ở Thành phố Hồ Chí Minh) chúng tôi sử dụng có thể có trình tự gen cpn60 khác hoặc có thể xuất hiện nhiều SNP (single nucleotide
polymorphisms) so với chủng tham khảo (chủng Canada).