2. Vật liệu và phương pháp
2.2.3 Phương pháp Miles-Misra cấy trải theo bậc pha loãng và đếm CFU
CFU ước tính mật độ vi khuẩn trong dung dịch
Nguyên tắc
Phương pháp này nằm xác định mật độ vi khuẩn trong dung dịch bằng cách pha loãng dung dịch ban đầu theo một hệ số pha loãng xác định thành một dãy nồng độ giảm dần và nhỏ giọt trên đĩa thạch rồi đếm CFU (Colony Forming Unit). Mỗi CFU là một đơn vị hình thành khuẩn lạc, tương đương với một vi khuẩn ban đầu trong dung dịch gốc. Dựa vào hệ số pha loãng và thể tích nhỏ giọt, có thể tính được mật độ vi khuẩn ban đầu. Thông thường người ta tiến hành pha loãng theo bậc 10 để đơn giản hóa quá trình tính toán.
Các bước thực hiện
Bước 1: Cấy chủng S. suis ATTC 31533 lên môi trường BA. Ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ.
Bước 2: Chọn 1 khuẩn lạc S. suis ATTC 31533 tăng sinh trong môi trường THB trong 4 – 6 giờ.
Bước 3: Hút 100μl dịch vi khuẩn vào eppendorf có chứa 900 μl PBS. Trộn mẫu thật kỹ. Dung dịch này có nồng độ pha loãng 10-1. Tiếp tục chuyển 1 μl mẫu từ độ pha loãng 10-1 sang eppendorf chứa 900 μl PBS thứ 2. Trộn đều, dung dịch này có nồng độ pha loãng 10-2 . Tiếp tục tiến hành tương tự để có các độ pha loãng 10-3, 10-4…
Bước 4: Hút 10μl ở mỗi nồng độ pha loãng cho vào đĩa BA. Ở mỗi nồng độ pha loãng thực hiện 9 lần. Ủ 37oC, 5% CO2 trong 24 giờ.
Bước 5: Đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Từ đó, suy ra số tế bào vi khuẩn S. suis ATTC 31533 có trong dịch THB ban đầu.
Hình 2.1: Các bước cơ bản trong phương pháp Miles-Misra nhằm ước tính mật độ
tế bào vi khuẩn trong dung dịch
Cách tính kết quả:
M (CFU/ml) = A x D/V M: số khuẩn lạc trong 1ml dung dịch
A: Số khuẩn lạc trung bình trên mỗi đĩa thạch có cùng độ pha loãng ( chỉ có ý nghĩa tương ứng từ 25-250 khuẩn lạc)
D: Độ pha loãng