2. Vật liệu và phương pháp
2.2.5Thiết kế mồi và thành phần phản ứng trong phương pháp LAMP
2.2.5.1 Thiết kế mồi
Quy tắc:
Quá trình thiết kế mồi LAMP dựa vào 6 vùng trên trình tự đã được kiểm tra gen mục tiêu cpn60 của S. suis.
Các yếu tố quan trọng trong quá trình thiết kế mồi
Bốn yếu tố quan trọng trong quá trình thiết kế mồi bao gồm: Nhiệt độ nóng chảy (Tm), tình trạng ổn định đầu tận cùng của mỗi mồi, hàm lượng GC và cấu trúc thứ cấp.
Nhiệt độ nóng chảy (Tm)
Tm được ước tính bằng phương pháp Nearest-Neighbor. Phương pháp này cung cấp giá trị gần với giá trị thực. Giá trị Tm được tính toán dưới sự phối hợp những điều kiện thí nghiệm chẳng hạn như: nồng độ muối và nồng độ oligo ( Nồng độ oligo 0.1 µM, nồng độ ion Na+
50mM, nồng độ ion Mg2+ 4mM).
Nhiệt độ nóng chảy của mỗi mồi được thiết kế khoảng 65oC (64 – 65oC) đối với F1c và B1c, khoảng 60o
C (59 – 61oC) cho F2, B2, F3 và B3.
Sự ổn định đầu tận cùng của mồi
Đầu cuối của các mồi là điểm bắt đầu tổng hợp DNA, chính vì thế đòi hỏi một số điều kiện ổn định. Đầu 3’ của F2/B2, F3/B3 và đầu 5’ F1c/B1c được thiết kế với năng lượng tự do -4kcal/ mol hay ít hơn. Đầu 5’ của F1c sau khi khuếch đại tương ứng với đầu 3’ của F1 cũng cần sự ổn định.
Hàm lượng GC
Cấu trúc thứ cấp
Mồi trong FIP (Inner primer) khi thiết kế không hình thành cấu trúc thứ cấp.
Khoảng cách giữa các mồi
Các mồi được thiết kế sao cho khoảng cách từ vị trí cuối của F2 đến vị trí cuối B2 (vùng khuếch đại DNA bằng phản ứng LAMP) trong khoảng 120 đến 160 base. Khoảng cách từ điểm cuối F2 đến điểm cuối F1 (vị trí hình thành vòng (loop) trong khoảng 40 đến 60 base. Khoảng cách giữa F3 và B3 khoảng 0 đến 60 base. Bốn mồi LAMP được thiết kế dựa vào trình gen cpn60 của chủng
Streptococcuss suis BM 407 (GenBank Accession no: NC_012926 ) dưới sự hổ
trợ của phần mềm Vector NTI SuitBlast. So sánh trình tự gen cpn60 của S.suis
BM407 với 35 serotype S.suis [12] và xác định được vùng bảo tồn trên gen cpn60 giữa các chủng S. suis. Các mồi được thiết kế sử dụng phần mềm sắp giống cột
(alignment) bao gồm 2 mồi ngoài F3 and B3, 2 mồi trong gồm: mồi trong xuôi (forward inner primer – FIP) và mồi trong ngược (backward inner primer - BIP) (Bảng 2.3).
Mồi trong xuôi (FIP) chứa trình tự F1c (20 nt), đoạn TTTT, trình tự F2 (23 nt).
Mồi trong ngược (BIP) chứa trình tự B1c (23nt), đoạn TTTT, trình tự B2 (19 nt).
Các mồi này nhận diện 6 vùng khác nhau trên trình tự DNA mục tiêu (hình
Bảng 2.3: Thông số của mồi trong phản ứng LAMP
Hình 2.3: Vị trí của các mồi trên trình tự gen cpn60 của S. suis
Mồi Chiều dài Hàm lượng GC Nhiệt độ nóng chảy Tm F3 20 47.4% 59.6oC F2 23 39.1% 60.7oC F1c 20 60% 64.5oC B1c 23 47.8% 63.7oC B2 19 52.6% 61.1oC B3 23 39.1% 60.1oC 109 128 134 157 165 185 263 286 309 331 354 377 cpn60 gene
2.2.5.2 Hóa chất và dụng cụ sử dụng trong phản ứng LAMP
Hóa chất
Thermopol buffer (Biolabs). MgSO4 (Biolabs).
Dung dịch đệm cho phản ứng PCR 10X, dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (Roche). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Betaine solution (Sigma).
4 cặp mồi (FIP, BIP, F3, B3) (Sigma). Pico green (Invitrogen).
Bst DNA polymerase (Biolabs)
Dụng cụ
PCR 8-strip
Máy PCR (Eppendorf) Lò vi sóng
Bồn điện di (Bio Rad)
Máy chụp hình gel (Bio Rad)
2.2.5.3 Phản ứng LAMP phát hiện S. suis dựa trên trình tự gen cpn60
Thành phần phản ứng LAMP được pha theo nghiên cứu của Jaroenrama et al, (2008) với thể tích 25 μl.
Chương 3
KẾT QUẢ
3. Kết quả
3.1 Xác định độ đặc hiệu của mồi cpn60 bằng phản ứng PCR
Khảo sát độ đặc hiệu mồi trong phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 33 serotype S. suis (serotype 1 – 34, ngoại trừ serotype ½ và 8) và 9
chủng vi khuẩn khác Klebsiella, E.coli ATCC 25922, Acinetobacteria, Pseudomonas, Salmonella, Streptococcus pneumonia ATCC 33400 (S.pneumonia), Methicillin-resistance staphylococcus aureus (MRSA), Methicillin-
susceptibleStaphylococcus aureus (MSSA), Pasteurella multocida (phụ lục 1).
Hình 3.1: Độ đặc hiệu mồi của phản ứng PCR. Giếng 1-11 (Klebsiella, E.coli,
Acinetobacteria, Pseudomonas, Salmonella, S.pneumonia, MRSA, MSSA, Pasteurella multocida, S. suis serotype 32, S. suis serotype 34).
300 bp 270 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 P N M
Bảng 2.4: Thành phần hóa chất trong phản ứng LAMP
Tiến hành phản ứng theo chương trình sau: Bước 1: 61oC/ 80 phút
Bước 2: 80oC/ 5 phút. Phân tích sản phẩm
Sản phẩm khuếch đại nhìn thấy bằng mắt thường sau khi cho thêm 2 μl Pico Green (Invitrogen) vào hỗn hợp, quan sát sự đổi màu của phản ứng. Nếu có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại thì phản ứng có màu vàng, ngược lại hổn hợp có màu cam. Hơn nữa sản phẩm khuếch đại điện di trên gel agarose 1,5% ở 150V trong vòng 45 phút, sau đó quan sát dưới tia UV sản phẩm hình thành là vạch smear kéo dài.
Tác chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích (μl/phản ứng) Thermopol buffer 10X 1X 2,5 MgSO4 100 mM 6 mM 1,25 dNTPs 10 mM 0,9 mM 2,25 Betaine 5M 0,8 mM 4 Primer FIP 20 μM 1,6 μM 2 BIP 20 μM 1,6 μM 2 F3 20 μM 0,2 μM 0,25 B3 20 μM 0,2 μM 0,25 Bst DNA polymerase 8000 U 8U 1 Nước / / 4,25 DNA khuôn / / 5 Tổng 25