1. Tổng quan
1.5 Phương pháp Loop mediated isothermal amplification (LAMP)
1.5.1 Sơ lược về một số phương pháp chẩn đoán tác nhân gây bệnh
Hiện nay, việc chẩn đoán và phát hiện tác nhân gây bệnh trong điều trị bệnh nhiễm thường được tiến hành dựa trên nền tảng của kỹ thuật nuôi cấy phân lập vi sinh truyền thống và gần đây là các phương pháp sinh học phân tử dựa vào việc khuếch đại và giải trình tự nucleic acid. Tuy vậy các phương pháp này vẫn còn một số hạn chế nhất định.
- Nuôi cấy vi sinh là phương pháp truyền thống và thường được xem là tiêu chuẩn vàng trong việc chẩn đoán và xác định tác nhân gây bệnh. Tuy vậy hiệu suất nuôi cấy thấp trong trường hợp bệnh nhân sử dụng kháng sinh, nồng độ vi khuẩn trong mẫu thấp. Ngoài ra, vi sinh mục tiêu có thể bị định danh nhầm thành các loài vi sinh có tính chất sinh hóa tương tự, chẳng hạn S. suis thường bị được định danh nhầm thành Enterococcus faecalis, Aerococcus viridians và các loài Streptococcus tiêu huyết alpha [17], [54]. Bên cạnh đó, nuôi cấy đòi hỏi kỹ năng của kỹ thuật viên, tốn nhiều thời gian, chi phí cao.
- PCR là phương pháp phát hiện tác nhân mục tiêu dựa vào nucleic acid và quan sát kết quả trên gel agarose. Bên cạnh những ưu điểm về độ nhạy, độ đặc hiệu cao thì PCR vẫn có khuyết điểm: đòi hỏi trang thiết bị hay hệ thống luân nhiệt, hóa chất chuyên dụng và đắt tiền, quá trình thiết kế mồi, tối ưu hóa phản ứng khó khăn và mất thời gian, tiếp xúc hóa chất độc hại (ethidium bromide) [72].
- Real time PCR là một biến thể của phương pháp PCR truyền thống, với ưu điểm lớn nhất là tính hiệu quả và thời gian tiến hành. Real-time PCR khuếch đại và phát hiện mục tiêu trong quá trình phản ứng xảy ra mà không cần điện di trên
gel agarose như PCR truyền thống nên thời gian thí nghiệm được rút ngắn đáng kể. Tuy nhiên Real time PCR đòi hỏi hóa chất và thiết bị đắt tiền dẫn đến chi phí cho từng phản ứng cao hơn so với phương pháp PCR, do vậy khó có thể triển khai ở những cơ sở nghiên cứu không đủ điều kiện cơ sở vật chất và khó ứng dụng rộng rãi cho chẩn đoán [18], [73].
1.5.2 Lịch sử ra đời và ứng dụng của phương pháp LAMP
Một vài thập kỷ qua, việc cải tiến một số phương pháp chẩn đoán đặc biệt dựa vào trình tự nucleic acid của tác nhân gây bệnh với các ưu điểm: chẩn đoán nhanh, tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng polymerase chain reaction (PCR), realtime PCR. Năm 2000, Notomi cùng cộng sự phát triển phương pháp khuếch đại DNA trong điều kiện đẳng nhiệt (Loop mediated isothermal amplification – LAMP) với độ đặc hiệu, hiệu quả cao [72].
Khác với phương pháp PCR, mạch đôi DNA không cần biến tính trong quá trình khuếch đại bằng LAMP, tuy nhiên vẫn hình thành số lượng lớn sản phẩm khuếch đại DNA trong khoảng thời gian ngắn và phản ứng dương tính của LAMP phát hiện bằng mắt thường [66]. Ưu điểm chủ yếu của kỹ thuật này sử dụng trang thiết bị đơn giản: bồn nước nóng, máy ủ nhiệt (heating blook) khi khuếch đại DNA. Phương pháp LAMP tận dụng ưu điểm Bst polymerase và một loạt 4 mồi
nhận biết 6 trình tự khác nhau trên DNA mục tiêu.
Dù mới ra đời nhưng LAMP được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực chẩn đoán mầm bệnh, virus trong thủy sản, phát hiện nhanh vi khuẩn trong bệnh phẩm, môi trường, thực phẩm ... Do đó, LAMP là phương pháp khuếch đại gen tiềm năng có nhiều hứa hẹn trong các lĩnh vực nghiên cứu mới.
1.5.3 Nguyên tắc hoạt động LAMP
Phương pháp LAMP dựa trên sự tổng hợp DNA thay thế mạch tự xoay vòng (auto - cycling strand displacement) được thực hiện bởi DNA polymerase với hoạt động thay thế mạch và một loạt 4 mồi bao gồm: 2 mồi ngoài (outer primers)
và 2 mồi trong (inner primers). Trong giai đoạn đầu của phản ứng LAMP tất cả 4 mồi được sử dụng, tuy nhiên sau đó trong suốt chu kỳ phản ứng chỉ còn lại 2 mồi trong (inner primers) được sử dụng cho quá trình tổng hợp DNA.
Hai mồi trong (inner primers) bao gồm mồi trong xuôi (Forward inner primer - FIP) và mồi trong ngược (Backward inner primer - BIP) và mỗi mồi có hai trình tự riêng biệt tương ứng trình tự sense và antisense của DNA mục tiêu, một cho việc mồi ở giai đoạn đầu và cái còn lại tự làm mồi ở giai đoạn sau.
Trình tự bên trong hiện diện ở 2 đầu của mạch DNA mục tiêu ký hiệu F2c và B2 có chứa khoảng 23-24 nucleotide. Hai trình tự trong chứa khoảng 23-24 nucleotide cách trình tự F2c và B2 khoảng 40 nucleotide ký hiệu F1c và B1. Hai trình tự nằm bên ngoài tương ứng 2 vị trí F2c và B2 của DNA đích chứa khoảng 17-21 nnucleotide ký hiệu F3c và B3. Dựa vào cấu trúc này, FIP và BIP được thiết kế như sau:
FIP chứa F1c, một đoạn TTTT và F2 (bổ sung với F2c). BIP chứa B1c (bổ sung với B1), một đoạn TTTT và B2.
Hai mồi ngoài chứa F3 (bổ sung với F3c), B3 (bổ sung với B3c).
Phản ứng thực hiện có sự tham gia của enzyme Bst polymerase hoạt động ở
nhiệt độ 65oC trong 1h.
1.5.4 Cơ chế hoạt động
Các bước khởi đầu
Mồi trong FIP lai với F2c, sau đó mồi ngoài F3 lai với F3c trên trình tự DNA đích và từ đó bắt đầu quá trình khởi động thay thế mạch DNA. Mồi F3 hoạt động sau mồi FIP nguyên nhân do trình tự nucleotide F3 ngắn và nồng độ thấp hơn FIP trong phản ứng LAMP. Từ đó giải phóng mạch DNA bổ sung liên kết với FIP có cấu trúc vòng ở bên ngoài của một đầu (bước 4). Mạch đơn DNA này sẽ làm khuôn cho quá trình tổng hợp tiếp theo bởi sự hoạt động của mồi BIP và sự tổng hợp DNA thay thế mạch bởi mồi F3, từ đó hình thành sản phẩm DNA có cấu trúc giống quả tạ (bước 6).
Các bước khuếch đại theo chu kỳ
DNA hình quả tạ nhanh chóng chuyển sang dạng thân - vòng (stem - loop DNA) bởi quá trình tự làm mồi tổng hợp DNA (bước 7). Sau đó, cấu trúc thân vòng này sẽ làm khuôn cho các bước khuếch đại DNA theo chu kỳ tiếp theo.
Giai đoạn đầu quá trình tổng hợp DNA theo chu kỳ của phản ứng LAMP, FIP lai với vòng nằm trên cấu trúc DNA thân vòng (bước 7) hình thành nên cấu trúc DNA thân vòng có một khoảng trống và một bản sao thân – vòng đảo ngược của trình tự DNA đích được hình thành ở phía đối diện thông qua mồi BIP (bước 8). Sau đó quá trình tổng hợp DNA thay thế mạch do sự tự làm mồi hình thành nên cấu trúc thân vòng (stem-loop) (bước 9) và một cấu trúc thân vòng có khoảng trống được sửa chữa, trong đó chiều dài thân gấp đôi trình tự DNA đích và một vòng nằm ở đầu đối diện (bước 10). Cả hai sản phẩm này làm mạch khuôn cho quá trình tổng hợp DNA bởi mồi BIP trong chu kỳ tiếp theo, trong đó một phần sử dụng cho giai đoạn kéo dài còn phần còn lại làm vật liệu cho giai đoạn tái lại chu kỳ. Vì vậy trong phản ứng LAMP trình tự đích được khuếch đại 3 lần trong nữa chu kỳ. Sản phẩm cuối cùng là hổn hợp DNA cấu trúc thân vòng với chiều dài thân khác nhau và cấu trúc giống như hoa súp lơ với việc hình thành nhiều vòng bởi quá trình bắt cặp giữa các trình tự lặp lại đảo ngược trong cùng một mạch.
(Natomi cùng cộng sự, 2000)
1.5.5 Đánh giá kết quả LAMP
1.5.5.1 Đánh giá kết quả LAMP bằng điện di
Một số phương pháp có thể được sử dụng để phát hiện kết quả dương tính của phản ứng LAMP. Phương pháp phổ biến được sử dụng điện di trên gel agarose nhuộm ethidium bromide. Kết quả LAMP dương tính sẽ cho một vạch smear dài tượng trưng nhiều kích thước thân-vòng khác nhau.
Sản phẩm LAMP Thang 100 bp
Hình 1.9: Sản phẩm khuếch đại của phản ứng LAMP
1.5.5.2 Quan sát kết quả LAMP bằng mắt thường
Ngoài phương pháp điện di trên gel agarose, kết quả dương tính của phản ứng LAMP có thể nhận thấy bằng mắt thường thông qua sự chuyển màu của sản phẩm nhờ vào các các chất chỉ thị màu thích hợp.
Quan sát độ đục sản phẩm
Kết quả của phản ứng LAMP có thể quan sát thông qua độ đục của hỗn hợp phản ứng. Một đặc điểm phương pháp LAMP tổng hợp một lượng lớn DNA, tương ứng đó lượng lớn sản phẩm phụ ion pyrophosphate giải phóng từ dNTP. Phản ứng xảy ra giữa ion magnesium trong phản ứng LAMP với ion pyrophosphate hình thành độ đục trong sản phẩm (hình 1.10) [66] :
(DNA)n-1 + dNTP = (DNA)n + [P2O7]4- [P2O7]4- + 2Mg2+ = Mg2P2O7
(Notomi và cộng sự, 2005)
Hình 1.10: Độ đục sản phẩm khuếch đại của phản ứng LAMP
Quan sát màu huỳnh quang của sản phẩm
Sản phẩm khuếch đại có thể quan sát tốt hơn bằng mắt thường khi có sự hiện diện chất phát huỳnh quang: ethidium bromide, SYBR Green I, Pico green, Calcein...
Calcein là chất chỉ thị kim loại (metal indicator) phát huỳnh quang mạnh khi tương tác với ion kim loại hóa trị II. Tomita cùng cộng sự tiến hành thí nghiệm cho calcein vào hỗn hợp phản ứng LAMP, tuy nhiên không quan sát thấy sự chuyển màu của phản ứng nguyên nhân do ion Mg2+
kết hợp ion pyrophosphate hình thành dạng muối không tan nên nồng độ của ion Mg2+
giảm do đó làm giảm sự tương tác giữa Mg2+ với calcein . Sau đó tác giả bổ sung thêm ion Mn2+ và quan sát nhận thấy có sự đổi màu hỗn hợp phản ứng [96].
Hình 1.11: Quá trình phát hiện sản phẩm khuếch đại sử dụng chất chỉ thị huỳnh quang kim loại (calcein). Sản phẩm phụ ion pyrophosphate được hình thành từ cơ chất deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs). Giai đoạn đầu Calcein kết hợp với Mn2+ trong phản ứng, sau khi quá trình khuếch đại diễn ra,
Mn2+ tách khỏi calcein và kết hợp với ion P2O7. Sau đó các calcein tự do sẽ kết hợp với ion Mg2+
trong phản ứng và phát huỳnh quang.
Ethidium bromide, SYBR Green I, Pico Green … là những chất chèn vào DNA mạch đôi và phát huỳnh quang [27], [98].
Hình 1.12: Pico green đổi màu khi có sự hình thành sản phẩm trong phản ứng
LAMP (màu vàng: dương tính, màu cam: âm tính).
1.5.6 Ưu điểm phương pháp LAMP
- Quá trình khuếch đại DNA bằng phương pháp LAMP có tính hiệu quả cao và không bị ảnh hưởng bởi DNA ngoại nhiễm.
- Sản phẩm khuếch đại là hỗn hợp DNA thân –vòng (stem-loop) với nhiều kích thước khác nhau nên phát hiện một cách dễ dàng.
- Phản ứng LAMP có tính đặc hiệu cao với trình tự DNA đích và không cần giai đoạn biến tính mạch DNA. Phản ứng hoàn tất nhanh khoảng 1h. Ngoài ra, sản phẩm DNA phát hiện bằng mắt thường không đòi hỏi quá trình điện di.
- Phương pháp LAMP đơn giản, dễ thực hiện với 4 mồi, DNA polymerase, và thiết bị đơn giản: bồn nước nóng, máy ủ nhiệt.
- Bằng cách kết hợp với reverse transcription, LAMP có thể khuếch đại trình tự RNA với hiệu quả cao.
Chương 2
VẬT LIỆU
2. Vật liệu và phương pháp 2.1 Vật liệu 2.1 Vật liệu
2.1.1 Chủng vi khuẩn S. suis
33 chủng S. suis phân lập từ amidan ở heo khỏe và dịch não tủy bệnh nhân viêm màng não được liệt kê và 12 chủng vi khuẩn khác: Klebsiella, E.coli ATCC 25922, Acinetobacter, Pseudomonas, Salmonella, Streptococcus pneumonia
ATCC 33400, Methicillin-resistance staphylococcus aureus (MRSA), Methicillin-
susceptible Staphylococcus aureus (MSSA), Pasteurella multocida, Enterococcus
faecium (phụ lục 1).
Chủng đối chứng: S.suis serotype 2 ATCC 31533 phân lập ở Châu Âu, có những yếu tố gây độc như MRP (muramidase-released protein), EF (extracellular factor), và suilysin.
Chủng S. suis CM 368 phân lập từ bệnh nhân viêm màng não (chủng S. suis nhạy với ceftriaxone).
2.1.2 Trang thiết bị và hóa chất
Đệm PBS pH 7,4 (Phosphate buffer saline)
NaCl 0,015M KCl 0,003M Na2HPO4 0,01M NaH2PO4 0,025M
Môi trường BA (Blood agar)
Môi trường BA là môi trường thạch máu. Trên môi trường thạch máu, có thể phân biệt 3 dạng tiêu huyết như sau:
Tiêu huyết kiểu alpha: tiêu huyết không hoàn toàn. Vi khuẩn có khả năng oxi hóa các tế bào máu tạo thành vòng có màu xanh lục xung quanh khuẩn lạc.
Tiêu huyết kiểu beta: tiêu huyết hoàn toàn. Vi khuẩn có khả năng phân giải hoàn toàn các tế bào máu tạo thành vòng tiêu huyết xung quanh khuẩn lạc.
Tiêu huyết kiểu gamma: không có sự thay đổi màu của môi trường. Thành phần môi trường BA (pH = 7,4) Thành phần g/l Meat extract 15 Liver digest 2,5 Yeast extract 5 NaCl 5 Agar 12 H2O Vừa đủ 1 lít
Sau khi khử trùng, để môi trường nguội từ 40 – 45oC, bổ sung thêm máu cừu với nồng độ cuối cùng là 100 μg/ml.
Môi trường THB (Todd Hewith Broth)
S.suis được tăng sinh trong môi trường lỏng THB có thành phần như sau:
Thành phần g/l
Beef heart infusion 3,1
Peptone 20 Dextrose 2 NaCl 2 Na2HPO4 0,4 Na2CO3 2,5 pH 7,8
Khử trùng các hóa chất, dung dịch đệm và môi trường bằng cách hấp ướt ở 105oC trong 30 phút ( đối với môi trường) hay 121oC trong 20 phút hay lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thước 0,22 μm.
2.2 Các kỹ thuật trong nghiên cứu
2.2.1 Quy trình tách chiết DNA từ chủng thuần
Tách chiết DNA dựa theo quy trình Wizard® Genomic DNA purification Kit, Promega, Madison, WI, USA.
Vật liệu Isopropanol (nhiệt độ phòng) Ethanol 70% (nhiệt độ phòng) 50mM EDTA (pH 8,0) 100 mg/ml lysozyme (Sigma) Nước ELGA
Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong tách chiết
Bồn ủ nhiệt (Techne) Máy ly tâm (Eppendorf) Máy vortex (Jencons)
Máy sấy khô (ThermoSavant) Các loại pipette và đầu tip Eppendorf 1,5ml
Máy đo nồng dộ DNA (NanoDrop) Tủ âm -20oC (Sanyo)
Nguyên tắc tách chiết
Các giai đoạn cơ bản của tách chiết DNA bao gồm: (1) Phá màng tế bào và màng nhân
(3) Loại protein (4) Tủa DNA
Quy trình tách chiết
Sơ đồ 2.1: Quy trình tách chiết DNA từ chủng thuần Cặn tế bào
Huyền phù trong EDTA. Thêm enzyme ly giải
Thêm Nuclei Lysis Solution. Ủ ở 80o C trong 5 phút, sau đó thêm dung dịch RNase và ủ.
Thêm Protein
Precipation Solution
Quay ly tâm
Chuyển dịch nổi vào tube mới chứa isopropanol Quay ly tâm Loại bỏ dịch nổi. Thêm ethanol. Quay ly tâm Loại bỏ ethanol. Làm khô cặn lắng. Dung giải DNA.
1. Hút 1ml dịch nuôi cấy qua đêm cho vào tube quay ly tâm 1,5 ml.
2. Quay ly tâm 13.000 -16.000 vòng trong 2 phút, thu cặn lắng tế bào. Loại bỏ dịch nổi.
3. Hút 480μl EDTA 50mM vào cặn lắng tế bào.
4. Bổ sung 120μl enzyme ly giải, trộn đều bằng pipet. Enzyme ly giải làm yếu thành tế bào, nhờ đó giúp cho quá trình ly giải tế bào hiệu quả hơn. 5. Ủ mẫu ở 37°C trong 30–60 phút. Quy ly tâm 13.000 – 16.000 vòng
trong 2 phút và loại bỏ dịch nổi.
6. Thêm 600μl dung dịch Nuclei lysis. Trộn nhẹ bằng pipet.
7. Ủ 80oC trong 5 phút nhằm để ly giải tế bào, sau đó làm nguội ở nhiệt độ phòng.
8. Thêm 3μl RNAse Solution. Trộn đều. 9. Ủ 37o
C trong 15-60 phút. Làm nguội ở nhiệt độ phòng.
10.Bổ sung 200μl Protein Precipitation Solution. Trộn đều ở tốc độ cao nhất bằng máy vortex trong khoảng 20s.
11.Ủ mẫu trên đá trong 5 phút.
12.Quay ly tâm 13.000 – 16.000 vòng trong 3 phút.
13.Chuyển toàn bộ dịch nổi sang tube sạch có chứa 600μl isopropanol. Trộn đều.
14.Quay ly tâm 13.000 – 16.000 vòng trong 2 phút.
15.Cẩn thận đổ dịch nổi và làm khô tube trên giấy thấm sạch. Thêm 600μl ethanol 70% và trộn đều bằng việc đảo ngược tube.
16.Quay ly tâm 13.000 – 16.000 vòng trong 2 phút. Hút bỏ ethanol. Sau đó làm khô cặn lắng trong khoảng 10-15 phút.
17.Thêm 100μl DNA Rehydration Solution ủ 65oC trong 1h hay ủ qua đêm ở 4oC dung giảiDNA.
2.2.2 Tách chiết DNA vi khuẩn gram dương từ mẫu máu toàn phần dựa theo quy trình DNeasy Blood and Tissue Kit theo quy trình DNeasy Blood and Tissue Kit
Nguyên tắc chung
Quy trình tách chiết nucleic acid ứng dụng hoạt tính biến tính của các hoạt chất chaotropic (các chất có hoạt tính biến tính cực mạnh, có khả năng phá vỡ liên kết không gian của các đại phân tử như DNA, RNA, protein…) và silica matrix. Các muối chaotropic thường được dùng là guanidine isothiocynate (GuSCN), sodium iodide (NaI) và lithium chloride (LiCl) có khả năng phân giải các vỏ nang giàu lipid của vi khuẩn và các lớp bao ngoài của tế bào, ngoài ra còn có thể biến