2. Vật liệu và phương pháp
3.3.2 Xác định đường cong chết phụ thuộc thời gian (time kill-curve) của
Song song với quá trình khảo sát nồng độ ceftriaxone 8xMIC có thể tiêu diệt S. suis, chúng tôi tiến hành xác định đường cong chết phụ thuộc thời gian
(time kill – curve) của S. suis khi tiếp xúc với kháng sinh ceftriaxone 8xMIC. Thí nghiệm này nhằm mục đích đánh giá nồng độ vi khuẩn giảm tương ứng với các thời điểm khác nhau khi tiếp xúc với kháng sinh và xác định khoảng thời gian vi khuẩn S. suis không mọc trên thạch đĩa.
Chúng tôi chọn S.suis với nồng độ 1,47x105 cfu/ml ủ với ceftriaxone 8xMIC sau các khoảng thời gian: 1h, 2h, 4h, 8h, 16h, 24h.
Nồng độ S. suis CM 368 lúc ban đầu (0h) là 1,47x105 cfu/ml sau khi tiếp xúc với ceftriaxone 8xMIC nhận thấy rằng ở thời điểm 1h nồng độ S. suis bắt đầu giảm (so với mẫu không có kháng sinh – đối chứng). Sau đó mật độ vi khuẩn S. suis tiếp tục giảm mạnh sau các các thời điểm 2h, 4h, 8h, 16h và đến thì không còn
khuẩn lạc nào mọc trên đĩa thạch (tương đương với nồng độ S. suis trong dịch nuôi cấy bằng 0 cfu/ml) (đồ thị 3.1). Do đó, chúng tôi kết luận ceftriaxone với nồng độ 8xMIC (1,6 μg/ml) tiêu diệt S. suis ở nồng độ cao (1,47x105 cfu/ml) sau 24h. Kết
Nồng độ S. suis ban đầu (cfu/ml)
Nồng độ S. suis ủ với 8xMIC (cfu/ml) 1,47x106 4,25x105
1,47x105 0 1,47x104 0 1,47x103 0
quả trên phù hợp với thí nghiệm của Goonetilleke, tác giả và cộng sự chứng minh rằng khi sử dụng 1g ceftriaxone/10ml nước vô trùng trong quá trình điều trị bệnh nhân viêm màng não thì xác định nồng độ đỉnh kháng sinh (Cmax mg/ml) trong huyết thanh đạt được trong 1h điều này có nghĩa là ceftriaxone đạt nồng độ tối đa và mức độ diệt khuẩn trong 1h. Bên cạnh đó tác giả còn chứng minh rằng tác dụng diệt khuẩn của ceftriaxone duy trì trong thời gian 24h [26].
Đồ thị 3.1: Đường cong chết phụ thuộc thời gian của chủng S. suis CM368
nhạy ceftriaxone trong môi trường có ceftriaxone nồng độ 8xMIC. Trục X
biểu thị nồng độ vi khuẩn, trục Y biểu thị thời gian. Control: mẫu đối chứng – là môi trường nuôi cấy S. suis (1,47x105 cfu/ml) không chứa ceftriaxone; CRO: là môi trường nuôi cấy S. suis (1,47x105 cfu/ml) có chứa ceftriaxone nồng độ 8xMIC.
Kết quả trên chứng minh ceftriaxone bắt đầu có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn
S. suis (1,47x105 cfu/ml) ở thời điểm 1h và S. suis không mọc bất kỳ khuẩn lạc
nào trên môi trường thạch máu sau 24h. Điều này chứng tỏ 24h là thời điểm thích hợp chúng tôi tiến hành lấy mẫu nhằm so sánh độ nhạy giữa LAMP và nuôi cấy.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24T (h) L o g C F U /m l CONTROL CRO X8MIC
3.3.3 So sánh ngưỡng phát hiện giữa phương pháp nuôi cấy và LAMP
Từ kết quả trên chúng tôi tiến hành so sánh khả năng phát hiện S. suis trong
mẫu chứa ceftriaxone (nồng độ 8xMIC) bằng phương pháp nuôi cấy và LAMP. Chúng tôi tiến hành khảo sát ngưỡng phát hiện bằng phản ứng LAMP với các nồng độ S. suis khác nhau bao gồm 1,47x106; 1,47x105; 1,47x104 ; 1,47x103 cfu/ml.
Hình 3.14: Ngưỡng phát hiện phương pháp LAMP và sản phẩm được quan sát
bằng điện di: giếng 1-6 (1,47x106; 1,47x105 ; 1,47x104 ; 1,47x103 ; 7x102; 3,5x102 cfu/ml), giếng 7-9 ( 175 ; 70 ; 35 cfu/ml), giếng 10 (chứng dương), giếng 11 chứng âm), giếng M (thang 100bp).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
Bảng 3.3: So sánh ngưỡng phát hiện giữa phương pháp LAMP và nuôi cấy vi
sinh.
Phương pháp Nồng độ ban đầu Nồng độ pha loãng từ 1,47x103
cfu/ml
1,47x106 1,47x105 1,47x104 1,47x103 7x102 3,5x102 175 70
LAMP + + + + + + - -
Nuôi cấy + - - - - - - -
Quan sát sự chuyển màu Pico green và kết quả chạy điện di, LAMP phát hiện
S. suis từ nồng độ 3,5 x102 đến 1,47x106 cfu/ml (hình 3.14, bảng 3.3). Ngưỡng phát hiện bằng phương pháp LAMP được xác định 3,5x102
cfu/ml tương đương 8 cfu/phản ứng. Trong khi đó ngưỡng phát hiện của nuôi cấy trong trường hợp sử dụng ceftriaxone với nồng độ 8xMIC là > 1,47x105 cfu/ml. Kết quả chứng minh phương pháp LAM là 8 cfu/ml và nhạy hơn nuôi cấy trong trường hợp mẫu máu nhiễm S. suis đã sử dụng kháng sinh ceftriaxone (bảng 3.3).