CHƯƠNG I TỔNG QUAN
1.3. Phổ khối phân giải cao trong nghiên cứu lipid phân cực
Phổ khối phân giải cao (HRMS) xác định dạng phân tử của các phân lớp trong lớp lipid phân cực đã được phân tách bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), được ghi trên thiết bị Shimadzu LCMS-IT-TOF, do hãng Shimadzu (Kyoto, Nhật Bản) cung cấp.
LCMS-IT-TOF là một loại phổ kế mới kết hợp các cơng nghệ khối phổ bẫy ion quadrupol (quadrupol ion trap - QIT) và thời gian bay (time of flight - TOF). Sử dụng phương pháp khối phổ phân giải cao để đưa các ion vào QIT hiệu quả và phĩng đồng thời các ion bị bẫy vào TOF đã được giải quyết bằng cơng nghệ mới [74,75].
1.3.1. Hệ thống thiết bị LCMS-IT-TOF
1.3.1.1 Kỹ thuật khối tứ cực
Khối tứ cực (Q) được sử dụng nhiều nhất cho nguồn ion hĩa ESI và APCI. Ưu điểm: giá thành thấp, cĩ khả năng phân tích định tính và định lượng. Nhược điểm: độ phân giải thấp, yêu cầu mẫu tương đối tinh khiết và các tạp chất khơng ảnh hưởng đến khả năng phân giải. Khối tứ cực quadrupol kép cĩ hai hoặc ba quadrupol cĩ độ nhạy cao trong phân tích định lượng một chất đã biết, tạo được nhiều phân mảnh trong chế độ MS/MS, cĩ thể làm được kiểu đo mất phân tử trung hịa, thích hợp cho phân tích vi lượng các chất đã biết trước cấu trúc. Tuy nhiên khĩ giải thích cơ chế phân mảnh MS/MS.
Nguyên tắc hoạt động của kỹ thuật IT là các ion trước hết được bắt hoặc “mắc bẫy” trong một khoảng thời gian nhất định rồi được phân tích bằng MS hoặc MS/MS.
Ưu điểm: cĩ khả năng tích luỹ các ion, phân tích khối, phân lập ion và phân giã ion bằng va chạm, do vậy đây là phương tiện rất thuận lợi cho việc nghiên cứu cơ chế phân mảnh. Thiết bị cĩ giá thấp, độ nhạy tương đối cao và khả năng MS/MS phù hợp với hợp chất cĩ khối lượng phân tử lớn như protein và peptide.
Nhược điểm: độ chính xác trong phân tích định lượng khơng cao do chỉ cĩ một số lượng khá hạn chế các ion cĩ thể tích lũy vào tâm điểm trước khi được tích điện trong khơng gian, do vậy cĩ thể phản ánh sai lệch sự phân bố và phép đo. Do đĩ người ta tiến hành cải tiến kỹ thuật này bằng sự phát triển các bẫy ion “tuyến tính” hoặc “hai chiều” khi những ion được tập hợp trong một thể tích hình ống lớn hơn bẫy ion ba chiều truyền thống, cho phép làm tăng độ nhạy, độ phân giải và độ chính xác [76,77].
1.3.1.3. Kĩ thuật thời gian bay (Time of Flight - TOF)
Nguyên tắc hoạt động của kĩ thuật TOF: các ion đơn điện tích đặt trong thế năng V sẽ đạt một năng lượng chuyển hĩa eV. Do đĩ những ion cĩ khối lượng lớn hơn sẽ cĩ vận tốc nhỏ hơn nên mất nhiều thời gian để bay qua cùng một quãng đường dài trong một ống khơng cĩ từ trường. Các ion, sau khi được tăng tốc, bay ngang qua vùng khơng trường, nơi đây chúng sẽ được tách riêng nhau ra tùy theo giá trị m/z của chúng, và được tập trung tại bộ phận thu nhận tín hiệu. Sự phân tách ion trong bộ phân tích TOF dựa theo nguyên lí là các ion cĩ năng lượng ban đầu như nhau sẽ cĩ tốc độ tỉ lệ với giá trị m/z của chúng.
Ưu điểm: đo chính xác khối lượng mức độ 10-3 đến 10-4 m/z, thu tín hiệu
nhanh nhất trong tất cả các máy phân tích khối lượng, cĩ thể đo 100 - 200 phổ khối trong một giây. Phân tích các ion cĩ giá trị m/z bất kì do thời gian của các xung ion ở nguồn ion cĩ thể điều chỉnh theo mong muốn. Phân tích đa dạng các chất hữu cơ từ phân tử lượng nhỏ đến lớn, các chất từ phân cực đến ít phân cực, các chất khĩ bay hơi hay các chất ít bền nhiệt.
Nhược điểm: quá trình ion hĩa xảy ra trong pha lỏng nên rất dễ ảnh hưởng bởi chất lượng dung mơi, hệ đệm của dung dịch lên độ nhạy và độ chính xác của q trình phân tích.
Tùy theo mục đích, các nhà nghiên cứu sẽ chọn các kỹ thuật ứng với các máy khối phổ thích hợp. Ngồi ra, để phát huy những ưu điểm cũng như khắc phục các hạn chế của từng loại đầu dị, người ta cịn ghép nối kết hợp các kỹ thuật với nhau, ví dụ như hệ thống kết hợp giữa bẫy ion và tứ cực API - QTRAP 4000 hay QTRAP 5500 của hãng Applied Biosystems, trong đĩ tứ cực thứ ba của hệ ba tứ cực được thay bằng bẫy ion (IT) hoặc bẫy ion theo thời gian bay (IT - TOF). Cấu tạo khối phổ bẫy ion (QIT) và thời gian bay (TOF) được mơ tả ở hình 1.10.
Hình 1.10. Cấu tạo khối phổ bẫy ion (QIT) và thời gian bay (TOF)
1.3.2. Ứng dụng LCMS-IT-TOF trong nghiên cứu lipid phân cực
Khi phân tích bằng HPLC thì khoảng thời gian lưu và thứ tự các chất xuất hiện luơn được giữ cố định và lần lượt, thí dụ trong phân lớp phospholipid đầu tiên là PA đến PG, PC và cuối cùng là PI. Đây là dấu hiệu đầu tiên và là một trong những dấu hiệu quan trọng để khoanh vùng các nhĩm chất trước khi đi sâu vào xác định dạng phân tử của chúng.
Hình 1.11. Quá trình đo MSn
Mẫu phân tách từ thiết bị HPLC qua nguồn ion hĩa tạo thành các ion. Các ion này được chọn lọc qua mao quản khử để giảm sự va chạm ion cần chọn trong bộ phận tứ cực. Các ion sau khi được phân tách trong bộ phận tứ cực tiếp tục được tích lũy trong bộ phận bát cực rồi bơm nén đồng thời vào bẫy ion một cách hiệu quả.
Bẫy ion QIT cĩ khả năng cơ lập, phân mảnh ion tới MSn (n từ 1 - 10) nhờ cơng nghệ làm sạch mới và đây là chức năng hỗ trợ cho việc phân tích cấu trúc phân tử phức tạp rất hiệu quả (hình 1.11).
Để xác định các dạng phân tử của lipid phân cực chỉ cần 4 phổ khối MS+ (event 1) là peak [M+H]+ hoặc [M+ adduct]+, MS2+ (event 2), MS- (event 3) tương ứng với peak [M-H]- hoặc [M+ adduct]- và MS2- (event 4) (hình 1.12). Với những dạng phân tử thiếu thơng tin trên MS2 hoặc cần kiểm chứng lại thì cần đến MS3.
Hình 1.12. Cửa sổ lưu đồ tổng
Ưu điểm: Sắc kí lỏng hiệu năng cao kết nối phổ khối phân giải cao (HPLC-
HRMS) là cơng cụ rất hữu hiệu cho việc tách các hợp chất thiên nhiên, vừa cĩ thể định tính, định lượng các chất, vừa cĩ thể nghiên cứu cấu trúc các hợp chất lượng vết cĩ trong mẫu phân tích với độ chính xác cao. Khi kết hợp với hệ thống sắc ký, phổ khối cĩ thể được sử dụng như một detector phổ thơng, phát hiện hầu hết các chất nhưng với chế độ chọn lọc ion lại rất cĩ ích trong việc định lượng các chất trong một hỗn hợp phức tạp. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-). Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ thuật hiện nay đã cho phép tích hợp đồng thời hai kiểu quét cả ion (+) và ion (-) nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu.
Các thiết bị phân tích phổ khối ngày càng hiện đại và cho các kết quả cĩ độ tin cậy cao, giới hạn phân tích ngày càng được mở rộng. Với sự tiến bộ lớn trong các kỹ thuật phân tích, phổ khối giúp làm sáng tỏ các thơng tin về dạng phân tử của lipid, mở ra những hiểu biết mới trong nghiên cứu hĩa sinh lipid.