3.1. Chiết tách và xác định hàm lượng lipid tổng
Thực nghiệm tại Phịng Hố sinh hữu cơ, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển các sản phẩm thiên nhiên - Viện Hĩa học các hợp chất thiên nhiên.
50g mẫu được xay nhỏ, sau đĩ thêm vào 150ml CHCl3/MeOH (tỉ lệ 2:1, v/v) sau đĩ siêu âm 3 lần, mỗi lần 30 phút bằng máy siêu âm Elmasonic S100H, tần số 37KHz. Hỗn hợp thu được đem lọc lần 1 để thu dịch, bã cịn lại đem ngâm tiếp với 50ml CHCl3 và tiếp tục siêu âm như trên. Lọc dịch lần 2 đem gom với dịch lần 1, bổ sung thêm 40ml nước cất, lắc mạnh rồi đưa lên phễu chiết để phân thành 2 pha. Thu pha hữu cơ phía dưới chứa lipid, làm khan bằng Na2SO4. Sau đĩ, pha này được làm bay hơi dung mơi bằng máy cất cơ chân khơng Eyela N1300 để thu được lipid tổng. Cân bằng cân phân tích Sartorius analytic (độ chính xác 10-4g) và hàm lượng
lipid tổng được tính theo phần trăm so với khối lượng rong tươi ban đầu (phương pháp chiết được lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình).
Dùng sắc kí cột áp suất thường (CC), tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường, cỡ hạt 0,040 - 0,063mm để tách chiết loại lớp màu trong lipid tổng.
3.2. Xác định thành phần và hàm lượng các axit béo
Thực nghiệm tại Phịng Hố sinh hữu cơ, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển các sản phẩm thiên nhiên - Viện Hĩa học các hợp chất thiên nhiên và Trung tâm Khoa học Quốc gia về sinh vật biển, Viện HLKH Liên bang Nga.
Metyl hĩa: 10 mg lipid tổng được ủ với 2 ml H2SO4 2% trong CH3OH ở
80°C trong 2 giờ, sau đĩ bổ sung 2 ml n-hexan và 100 µl nước, lắc mạnh. Để hỗn hợp tách pha hồn tồn và thu nhận phần hữu cơ phía trên. Loại dung mơi khỏi pha hữu cơ và làm sạch hỗn hợp dịch bằng TLC trong dung mơi hexan: dietyl ete (95:5) (v:v) thu được metyl este của các axit béo (FAME).
Các kết quả nhận dạng và tính tốn trên máy sắc ký khí: FAME được phân
tích trên máy sắc ký khí Shimadzu GC- 2010 (Kyoto, Nhật Bản). Axit béo được xác định bằng giá trị thời gian lưu tương đương (ECL), dựa trên thời gian lưu của axit béo C16:0 và C18:0. Các cấu trúc axit béo được xác định bằng GC-MS. Các phổ được so sánh với thư viện NIST và kho lưu trữ khối phổ axit béo.
Kết quả tính giá trị thời gian lưu tương đương (ECL) theo cơng thức:
ECL = ±16 2(lgRTx – lgT16:0) lgRT18:0 – lgRT16:0
3.3. Xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất trong lipid tổng
Thực nghiệm tại Phịng Hố sinh hữu cơ, Trung tâm nghiên cứu và Phát triển các sản phẩm thiên nhiên - Viện Hĩa học các Hợp chất Thiên nhiên.
Dịch chiết lipid tổng sau khi được loại kiệt dung mơi bằng khí argon, hịa
tan trong CHCl3 (10mg/ml) trước khi đem chấm lên bản mỏng tráng sẵn Sorbfil (6cm × 6cm, Sorbfil, Krasnodar, LB Nga) với 3 nồng độ tăng dần sau đĩ đem triển khai với hệ dung mơi thứ nhất là n-hexane/diethyl ether/acetic acid (85:15:1, v:v:v) để nhận biết các lớp lipid trung tính và hệ dung mơi thứ hai là CHCl3/CH3OH/CH3COOH (2:1:0.1, v:v:v) để nhận biết lớp lipid phân cực.
Bản mỏng sau triển khai được hiện hình với thuốc thử H2SO4 10% trong CH3OH và sấy ở nhiệt độ 240oC trong 10 phút.
Sử dụng máy scan Epson Perfection 2400, Japan với thang màu xám, độ phân giải và kích thước tiêu chuẩn để thu được hình ảnh bản mỏng. Các lớp chất lipid trên bản mỏng và phần trăm các lớp chất được xác định dựa trên sự đo diện tích và cường độ màu trong chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer, Krasnodar, LB Nga.
3.4. Xác định các dạng phân tử lipid phân cực
Thực nghiệm tại trung tâm khoa học quốc gia về sinh vật biển, Viện Hàn lâm Khoa học Liên bang Nga.
Lipid tổng sau khi loại các lớp màu được bơm tự động vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) của hãng Shimadzu Prominence với 2 bơm áp suất cao, lị CTO-20A, thiết bị truyền dẫn CBM-20A, thiết bị khử khí DGU-20A3. Các lớp, phân lớp trong lipid tổng được tách trên cột Shim-Pack diol (4,6 mm x 50 mm, kích thước hạt 5 μm) (Shimadzu, Nhật Bản) bằng cách sử dụng hệ thống sắc ký Nexera-e (Shimadzu, Nhật Bản) trong hệ dung mơi A: n-hexan/2-propanol/axit formic/(C2H5)3N (82/17/1/0,08, v/v/v/v) và hệ dung mơi B: 2-propanol/H2O/axit formic/(C2H5)3N (85/14/1/0,08, v/v/v/v). Hàm lượng và cấu trúc của các dạng phân tử, các nhĩm chất ở các phân lớp trong lipid phân cực của rong biển được phát hiện bằng bẫy ion cĩ độ phân giải cao theo thời gian lưu của phép đo khối phổ, sử dụng thiết bị phổ khối phân giải cao (HRMS) LC/MS-IT-TOF (Shimadzu, Nhật Bản), q trình phân tích được thực hiện trong chế độ ion hĩa phun mù điện tử (ESI) với nhận dạng đồng thời các tín hiệu của ion dương và âm. Quá trình quét được thực hiện trong phạm vi m/z 100-1200. Các dạng phân tử riêng lẻ của lipid phân cực
được phát hiện bằng cách so sánh với các tiêu chuẩn xác thực trên phần mềm xử lý Shimadzu LC-MS (v.3.60.361), mỗi mảnh ion trong MS và MS/MS đã cĩ tính sai số tuyệt đối (difference). Sau khi kiểm tra sai số của các ion, cùng với độ bội của liên kết và dạng phân tử thỏa mãn chúng tơi sẽ chọn và xác định diacyl để từ đĩ xác định được dạng phân tử.
Phần trăm các dạng phân tử trong mỗi nhĩm chất ở các phân lớp lipid được tính bằng diện tích đỉnh của các ion âm [M-H]-, riêng các dạng phân tử PC, MGDG và DGDG,... được xác định bằng diện tích đỉnh của các ion dương [M+H]+ hay [M+Na]+, cụ thể như sau:
3.4.1. Xác định các nhĩm chất trong từng phân lớp lipid phân cực
Khi phân tích bằng HPLC thì thứ tự các chất xuất hiện luơn được giữ cố định. Trong phân lớp phospholipid đầu tiên là PA đến PG, PC và cuối cùng là PI. Trong phân lớp glycolipid đầu tiên là MGDG đến DGDG cuối cùng là SQDG và phân lớp betaine lipid đầu tiên là DGTS và tiếp theo là DGTA. Khoảng thời gian lưu (Rt) và thứ tự các nhĩm chất được đưa ra ở bảng 3.1. Đây là dấu hiệu đầu tiên và là một trong những dấu hiệu quan trọng để khoanh vùng các nhĩm chất trước khi đi sâu vào xác định dạng phân tử của chúng.
Bảng 3.1. Khoảng thời gian lưu của các nhĩm chất
Phân lớp Phospholipid Glycolipid Betaine lipid
Nhĩm chất PA PG PC PI MGD
G DGDG SQDG DGTS DGTA
Thời gian
lưu (phút) 3,5-5,6 5,4-6,8 7,5-11 16,5-20 2,5-3,5 8,5-14 10-16 3,5-5,5 4,5-7