15:0 16:1 n-7 16:1 n-5 16:0 18:3 n-6 18:2 n-6 18:3 n-3 18:1 n-9 18:1 n-7 18:0 20:4 n-6 20:5 n-3 20:0 14:0 0,26 0,12 0,10 -0,12 -0,14 -0,15 0,11 0,24 -0,05 0,07 -0,04 -0,28 -0,14 15:0 1,00 -0,13 0,00 0,55 -0,51 -0,45 -0,43 -0,25 0,07 0,64 -0,35 -0,24 -0,07 16:1n-7 1,00 -0,18 -0,24 -0,33 -0,08 -0,22 0,25 -0,40 -0,07 0,52 0,01 0,24 16:1n-5 1,00 -0,05 -0,06 0,02 -0,11 0,29 -0,04 -0,13 -0,31 0,33 -0,05 16:0 1,00 -0,27 -0,34 -0,46 -0,46 0,32 0,47 -0,47 -0,37 -0,02 18:3n-6 1,00 0,25 0,43 -0,17 0,41 -0,11 0,04 0,12 0,02 18:2n-6 1,00 0,26 0,25 -0,36 -0,28 0,06 0,28 -0,06 18:3n-3 1,00 0,00 0,18 -0,34 0,09 -0,19 -0,02 18:1n-9 1,00 -0,65 -0,06 0,12 0,04 -0,15 18:1n-7 1,00 0,13 -0,37 -0,23 0,11 18:0 1,00 -0,38 -0,43 0,01 20:4n-6 1,00 0,10 -0,16 20:5n-3 1,00 -0,02 20:0 1,00
Kết quả ở bảng 4.7 cho thấy mối tương quan nghịch giữa axit béo C18:1n-9 với C18:1n-7 (r = -0,65). Đối với axit C15:0 tìm thấy mối tương quan thuận với C18:0 (r = 0,64) và C16:0 (r = 0,55) và mối tương quan nghịch với C18:3n-6 (r = -0,51). Ngồi ra mối tương quan thuận giữa C16:1n-7 với C20:4n-6 (r = 0,52). Các tương quan khác đều ở mức yếu (giá trị tuyệt đối của r < 0,5), các axit béo
C22:0, C14:0, C16:1n-5, C20:5n-3, C18:2n-6 và C18:3n-3 cĩ mối tương quan với tất các các axit béo cịn lại đều yếu (với giá trị tuyệt đối cao nhất của r lần lượt là 0,24, 0,28, 0,33, 0,43, 0,45 và 0,46) vì vậy chúng tơi loại 6 axit béo này trong phân tích PCA cuối cùng.
Như vậy, chúng tơi đã xác định được 8 axit béo chính yếu gồm các axit béo: C15:0, C16:1n-7, C16:0, C18:3n-6, C18:1n-9, C18:1n-7, C18:0, C20:4n-6 cĩ hàm lượng được trình bày ở phụ lục 3. Bằng phương pháp phân tích cấu tử chính (PCA) kết hợp với phần mềm JMP sử dụng 8 axit béo chính yếu như ở trên, chúng tơi đưa ra sơ đồ phân bố rong biển trong mặt phẳng 2 chiều ở hình 4.2 dưới đây.
Hình 4.2. Biểu diễn phân tích PCA của 50 mẫu rong biển trên mặt phẳng 2 chiều
Kết quả phân tích cho thấy, trên hệ trục tọa độ hai chiều của PCA, thành phần PC1 (component 1) và PC2 (component 2) chiếm 58,8% tổng biến thiên, trong đĩ PC1 là 39,1% và PC2 là 19,7%. Cùng với đĩ 50 mẫu rong biển đã phân bố thành 3 vùng riêng biệt tương ứng với 3 ngành rong Đỏ, rong Nâu, rong Lục trên mặt phẳng 2 chiều (hình 4.2). Nhĩm thứ nhất là ngành rong Nâu (Phaeophyta), sự phân bố phụ thuộc vào hàm lượng cao của 3 axit béo C16:1n-7, C18:1n-9, C20:4n-6. Nhĩm thứ 2 là ngành rong Đỏ (Rhodophyta) sự phân bố phụ thuộc vào ưu thế về hàm lượng của 3 axit béo là C15:0, C16:0 và C18:0. Nhĩm thứ 3 là ngành rong Lục
(Chlorophyta) sự phân bố phụ thuộc ưu thế về hàm lượng của 2 axit béo C18:1n-7, và C18:3n-6.
Kết quả ở hình 4.2 cũng cho thấy, một số mẫu cĩ xu hướng phân bố lẫn sang các ngành khác, nhất là các mẫu rong Đỏ và rong Nâu, cụ thể là 5/18 mẫu rong Đỏ phân bố lẫn với rong Nâu, 3/23 mẫu rong Nâu phân bố lẫn với rong Đỏ và 1/23 mẫu rong Nâu phân bố lẫn với rong Lục. Ngồi ra các mẫu rong Nâu thu ngồi khơi cĩ xu hướng phân bố tản mạn hơn so với các mẫu thu gần bờ thể hiện ở nhiều mẫu ngồi khơi phân bố phía rìa vùng phân bố rong Nâu và cĩ 3/4 mẫu rong Nâu phân bố lẫn sang các ngành rong Đỏ và rong Lục là mẫu xa bờ. Trong khi đĩ, đối với rong Đỏ và rong Lục khơng thấy sự phân biệt rõ ràng đối với hai nhĩm thu gần bờ và mẫu thu ngồi khơi.
Sự phân bố xen lẫn của một số mẫu thuộc ngành rong Nâu và rong Đỏ như trên là do đây là đối tượng thực vật đa bào bậc thấp và sống phân bố đa dạng từ vùng trên triều đến vùng dưới triều và trên nhiều loại nền đáy từ đáy mềm ở các bãi triều, cửa sơng hay nền đá các rạn san hơ, chính vì vậy sự sinh tổng hợp các axit béo phụ thuộc nhiều vào yếu tố như mơi trường sống, nhiệt độ, điều kiện dinh dưỡng, thời kì sinh trưởng phát triển và sự đe dọa của các lồi sinh vật khác… tương tự như nhận định của một số tác giả đã cơng bố trước đây [106,107].
Đặc biệt các mẫu thuộc ngành rong Lục phân bố khá tập trung thành 1 vùng riêng biệt mà khơng cĩ mẫu nào lẫn sang hai ngành rong biển cịn lại. Điều này cĩ thể xuất phát từ nguyên nhân các mẫu rong Lục chủ yếu sinh trưởng và phát triển trên bề mặt nền đá cứng ở các bãi triều nên thành phần và hàm lượng các axit béo khơng chịu nhiều tác động của điều kiện mơi trường, dinh dưỡng như các lồi thuộc ngành rong Nâu, rong Đỏ...
Như vậy bằng phương pháp phân tích cấu tử chính PCA, sử dụng bộ dữ liệu gồm 8 axit béo chính yếu C15:0, C16:1n-7, C16:0, C18:3n-6, C18:1n-9, C18:1n-7, C18:0 và C20:4n-6 đã phân bố 3 ngành rong Nâu, rong Đỏ, rong Lục thành 3 vùng riêng biệt trên mặt phẳng hai chiều, trong đĩ rong Nâu đặc trưng bởi 3 axit béo chiếm ưu thế về hàm lượng là C16:1n-7, C18:1n-9 và C20:4n-6, rong Đỏ là 3 axit béo C15:0, C16:0, C18:0 và rong Lục là 2 axit béo C18:1n-7 và C18:3n-6. Cùng với các cơng bố gần đây, nghiên cứu này tiếp tục cho thấy khả năng sử dụng các axit
béo chính yếu như dấu hiệu để phân loại hố học đối với các lồi rong biển ở cấp độ ngành [113-114].
Kết luận
- Hàm lượng và thành phần lipid tổng, các lớp chất và axit béo của rong biển phụ thuộc vào lồi, điều kiện sinh trưởng và thời gian thu mẫu. Trong ngành rong Đỏ cĩ hiện tượng bất thường ở lồi Hypnea panosa J. Ag. Kết quả khảo sát cho
thấy 3 mẫu 1A, 1B và 20B thu ở Nha Trang khơng cĩ hoặc chỉ cĩ rất ít DHA (0,27%) trong khi mẫu 12KT thu ở Cơn Đảo cĩ hàm lượng DHA rất cao (43,69%), ngồi ra thành phần axit oleic (18:1n-9) của 12KT là 5,87% cịn các mẫu thu ở Nha Trang lại dao động từ 12,5- 14,26%. Cần tiếp tục nghiên cứu thêm để tìm hiểu nguyên nhân.
- Hàm lượng tổng axit béo no (∑SFA) dao động trong khoảng 38,26 - 57,63% trong đĩ axit 16:0 là thành phần phổ biến nhất.
- Hàm lượng tổng axit béo khơng no, một nối đơi (∑MUFA) dao động trong khoảng 20,15 - 27,81% trong đĩ axit 18:1n-9 là thành phần phổ biến nhất.
- Hàm lượng tổng axit béo khơng no, đa nối đơi (∑PUFA) dao động trong khoảng 10,14 - 27,99%. Một số mẫu cĩ hàm lượng omega3 và omega6 cao vượt trội như mẫu 1KT (Lobophora sp.) cĩ ∑PUFA là 59,98% trong đĩ DHA 14,26%, EPA 11,56%, AA 12,14%; mẫu 23KT cĩ ∑PUFA là 63,89% trong đĩ omega3 39,0% (EPA 33,58%), omega6 24,42% (AA 23,4%) và mẫu 12KT cĩ ∑PUFA là 46,01% trong đĩ omega3 44,86% (DHA 43,69%).
- 90% các mẫu rong (53/60) cĩ lipid vượt tiêu chuẩn của WHO về chỉ số n- 3/n-6 tốt cho sức khỏe (>0,1).
Kết quả phân tích thành phần lipid và axit béo khơng chỉ là minh chứng cho sự đa dạng sinh hĩa học mà cịn được sử dụng trong phân loại hĩa học.
Trên cơ sở kết quả sàng lọc lipid và axit béo chúng tơi đã lựa chọn hai lồi
Lobophora sp. (1KT) và Halimeda incrassata Lamx. (TSL) đại diện cho các mẫu thuộc ngành rong Nâu và rong Lục thu ở Cơn Đảo và Trương Sa là hai vùng đảo xa bờ đặc thù của Việt Nam để nghiên cứu các dạng phân tử lipid phân cực và khảo sát hoạt tính sinh học in vitro. Cả hai lồi đều cĩ hàm lượng lipid phân cực, axit béo
khơng no đa nối đơi PUFA và chỉ số n-3/n-6 cao. Thêm vào đĩ Lobophora sp. là
Halimeda incrassata Lamx. phổ biến ở quần đảo Trường Sa và là một trong số ít
các thực vật cĩ khả năng tổng hợp CaCO3 rất cao (35-45%) ngang bằng san hơ, đĩng vai trị quan trọng trong việc hình thành các rạn và bảo vệ nền đáy trước bão lũ và dịng chảy xốy. Cho đến nay chưa hề cĩ cơng bố nào về lipid, axit béo và các dạng phân tử lipid phân cực của hai lồi này.
4.2. Xác định các dạng phân tử lipid phân cực của rong Nâu Lobophora sp.
Trong lipid tổng của Lobophora sp. cĩ khoảng 27,5% lipid phân cực. Các
dạng phân tử lipid phân cực được xác định bằng phương pháp HPLC - HRMS.
4.2.1. Xác định các dạng phân tử phospholipid
4.2.1.1. Xác định các dạng phân tử phosphatic acid
Trong nhĩm phosphatic acid (PA) của lồi rong Nâu Lobophora sp. chúng tơi đã xác định được dạng phân tử duy nhất là PA 40:8 (bảng 4.8).
Cơng thức cấu tạo chung của các phosphatic acid (PA) cĩ dạng:
Bảng 4.8. Các dạng phân tử phosphatidic acid (PA)
Rt (phút) PL (C:N)* Diacyl [M-H]- CTPT
4,37 PA 40:8 20:4/20:4 743,4609 C43H69O8P
* Số các nguyên tử carbon (C) và số liên kết đơi (N) trong các mạch acyl béo
Sắc kí đồ và phổ khối của PA 40:8 được mơ tả như sau (hình 4.3).
Trên phổ ion âm MS- của PA (hình 4.3b) quan sát thấy cĩ tín hiệu mạnh nhất của ion mang điện tích âm [M-H]- tại m/z 743,4609 [C43H68O8P]-. Cơng thức phân tử tương ứng là C43H69O8P (bằng phần mềm tính được m/z 744,4730, độ sai số
0,00483, số liên kết đơi là 11).
Ion âm này được lựa chọn để bắn phá MS2-. Trên phổ ion âm MS2- của ion [M-H]- (hình 4.3c) cĩ chứa các mảnh ion với các tín hiệu tại m/z 457,2260 do ion
[M-H]- cĩ m/z 743,4609 [C43H68O8P]- bị mất phân tử trung hịa là keten của axit béo 20:4 [C20H30O] cĩ m/z 286,2349 (axit béo 20:4 mất một phân tử nước) và tín hiệu
tại m/z 439,2215 tương ứng với ion [M-H]- bị mất một phân tử axit béo 20:4 [C20H32O2] cĩ m/z 304,2394. Với tín hiệu m/z 303,2243 chính là anion của axit béo
20:4 [C20H31O2]-. Vậy, PA 40:8 được xác định là diacyl glycerophosphatic acid, 20:4/20:4.
Căn cứ vào GC và GC-MS thành phần axit béo trong lipid tổng và phân đoạn lipid phân cực thì đây là PA 20:4n-6/20:4n-6.
Hình 4.3. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PA 40:8 [C43H68O8P]-.
(a) Sắc kí đồ HPLC của [C43H68O8P]-, (b) Phổ khối (MS-) của [C43H68O8P]-, (c) Phổ khối (MS2-) tại tín hiệu m/z 743,4609.
4.2.1.2. Xác định các dạng phân tử phosphatidylglycerol
Trong nhĩm phosphatidylglycerol (PG) của lồi rong Lobophora sp., chúng
tơi đã xác định được 22 dạng phân tử trong đĩ cĩ 6 dạng PG xuất hiện các đồng phân (bảng 4.9).
Cơng thức cấu tạo của phosphatidylglycerol (PG) cĩ dạng:
Trong bảng 4.9, PG cĩ hàm lượng cao nhất 41,83% là PG 34:2. Trên phổ ion âm MS- của PG quan sát thấy cĩ tín hiệu mạnh nhất là ion [M-H]- tại m/z 745,4985 [C40H74O10P]- (hình 4.4b). Cơng thức phân tử xác định được là C40H75O10P (phần mềm tính tốn là m/z 746,5098, sai số 0,00401 và cĩ 5 liên kết đơi).
Ion âm này được lựa chọn để bắn phá MS2-. Trên phổ MS2- của ion [M-H]- (hình 4.4c) cĩ chứa các mảnh ion với tín hiệu tại m/z 253,2137 tương ứng với phân mảnh anion carboxylate của axit béo 16:1 [C16H29O2]-, mảnh ion với tín hiệu tại m/z 281,2485 ứng với phân mảnh anion carboxylate của axit béo 18:1 [C18H33O2]-.
Bảng 4.9. Các dạng phân tử phosphatidylglycerol (PG)
Rt (phút) PL(C:N)* Diacyl [M-H]- CTPT Diện tích % trong PG
6,89 PG 30:1 14:0/16:1 691,4524 C36H69O10P 662226 0,31 6,59 PG 30:0 14:0/16:0 693,469 C36H71O10P 1596605 0,74 6,62 PG 32:2 16:1/16:1 717,4698 C38H71O10P 1849294 0,85 14:1/18:1 6,38 PG 32:1 16:0/16:1 719,4851 C38H73O10P 10712980 4,94 6,08 PG 32:0 16:0/16:0 721.5006 C38H75O10P 2326942 1.07 6,71 PG 34:4 16:1/18:3 741.4682 C40H71O10P 2996752 1.38 6,41 PG 34:3 16:1/18:2 743.4833 C40H73O10P 24034722 11,07 16:0/18:3 16:2/18:1 6,08 PG 34:2 16:1/18:1 745,4985 C40H75O10P 90811295 41,83 16:0/18:2 5,9 PG 34:1 16:0/18:1 747,5158 C40H77O10P 30984084 14,27 18:0/16:1 6,62 PG 36:6 16:1/20:5 765,4675 C42H71O10P 10160184 4,68 6,41 PG 36:5 16:0/20:5 767,482 C42H73O10P 24365935 11,22 16:1/20:4 6,11 PG 36:4 20:4/16:0 769,4938 C42H75O10P 3736133 1,72 20:3/16:1 5,9 PG 36:3 16:0/20:3 771,5138 C42H77O10P 3563397 1,64 5,78 PG 36:2 18:1/18:1 773,531 C42H79O10P 8304940 3,83 6,26 PG 35:6 18:1/20:5 793,4985 C44H75O10P 971240 0,45 Tổng 217076729 100,00
Với sự vắng mặt đồng thời của 2 phân tử glycerol [C3H8O3] m/z 92,0443 và keten của axit béo 16:1[C16H28O] 236,2147 trong ion [M-H]- tương ứng với tín hiệu
m/z 417,2395, mảnh ion với tín hiệu tại m/z 491,2738 và m/z 509,2838 ứng với ion
[M-H]- là [C40H74O10P]- cĩ m/z 745,4985 mất đi phân tử axit béo 16:1 [C16H32O2]
m/z 254,2247 và keten của axit béo 16:1 [C16H28O] cĩ m/z 236,2147. Do đĩ, PG
34:2 được xác định là đặc trưng của diacyl glycerophosphoglycerol, 16:1/18:1. Ngồi ra trên phổ ion âm MS2- của ion [M-H]- (hình 4.4c) cĩ mảnh ion với tín hiệu tại m/z 279,2349 tương ứng với phân mảnh anion carboxylate của axit béo 18:2 [C18H31O2]-. Mà cơng thức phân tử xác định được là C40H75O10P với số liên kết đơi là 5. Như vậy, tại cùng giá trị ion m/z 745,4985 [C40H74O10P]-, tồn tại hai dạng phân tử riêng biệt là đồng phân của nhau gồm PG 16:0/18:2 và PG 16:1/18:1 trong đĩ PG 16:1/18:1 chiếm hàm lượng chính. Kiểm tra trên GC và GC-MS thành phần axit béo trong lipid tổng và phân đoạn lipid phân cực là PG 16:0/18:2n-6 và PG 16:1n-7/18:1n-9.
Hình 4.4. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PG 34:2 [C40H74O10P]-.
(a) Sắc kí đồ HPLC của [C40H74O10P]-, (b) Phổ khối (MS-) của [C40H74O10P]- (c) Phổ khối (MS2-) tại tín hiệu tại m/z 745,4985.
Bằng cách tương tự như vậy chúng tơi đã xác định được các dạng phân tử cịn lại của PG trong bảng 4.9 (xem mục 3.4.2.2).
4.2.1.3. Xác định các dạng phân tử phosphatidylcholine
Các dạng phân tử của phosphatidylcholine (PC) trong lồi rong Nâu
Lobophora sp. được trình bày trong bảng 4.10. Kết quả đã xác định được 14 dạng
phân tử của PC, trong đĩ cĩ 1 dạng là đồng phân, chiếm gần 73% tổng số PC. Dạng cơng thức cấu tạo của phosphatidylcholine (PC):
Các tín hiệu của ion dương [M+H]+ và các ion âm [M+HCOO]-, [M-CH3]- đã được quan sát trong phổ HRMS của tất cả các dạng cơng thức của PC.
Bảng 4.10. Các dạng phân tử phosphatidylcholine (PC)
Rt (phút) PL (C:N)* Diacyl [M+H]+ CTPT Diện tích % trong PC
11,38 PC 28:0 14:0/14:0 678,5056 C36H72NO8P 11756534 15,33 10,30 PC 30:0 14:0/16:0 706,5375 C38H76NO8P 14795171 19,30 9,85 PC 32:1 14:0/18:1 732,5494 C40H78NO8P 4936287 6,44 16:0/16:1 9,4 PC 32:0 16:0/16:0 734,5677 C40H80NO8P 3120177 4,07 10,21 PC 34:4 14:0/20:4 754,5364 C42H76NO8P 5985467 7,81 9,91 PC 34:3 14:0/20:3 756,5515 C42H78NO8P 2491148 3,25 9,25 PC 34:2 16:0/18:2 758,5678 C42H80NO8P 4479380 5,84 9,01 PC 34:1 16:0/18:1 760,5819 C42H82NO8P 5370992 7,00 8,65 PC 34:0 14:0/20:0 762,6003 C42H84NO8P 811104 1,06 9,25 PC 36:4 16:0/20:4 782,5719 C44H80NO8P 8158233 10,64 9,07 PC 36:3 16:0/20:3 784,5839 C44H82NO8P 4246070 5,54 8,74 PC 36:2 16:0/20:2 786,5970 C44H84NO8P 2040904 2,66 9,01 PC 38:5 18:1/20:4 808,5837 C46H82NO8P 4074957 5,31 Chưa xác định 4408222 5,75 Tổng 76674646 100
PC 30:0 là dạng phân tử cĩ hàm lượng cao nhất (19,3%) cĩ ion formyl hĩa mang điện tích âm [M+HCOO]- tại m/z 750,5226 [C39H77NO10P]- (phần mềm tính
m/z 750,5232, sai số 0,0009), ion dương [M+H]+ tại m/z 706,5375 [C38H77NO8P]+ (phần mềm tính m/z 706,5309, sai số 0,0066) và ion âm [M-CH3]- ở tín hiệu m/z
690,5025 [C37H73NO8P]- (phần mềm tính m/z 690,5052, sai số 0,0027) (hình 4.5b). Ở giai đoạn MS- (hình 4.5c), ion âm m/z 750,5226 đã mất một phân tử
C2H4O2 (methyl formate) tạo thành ion [M-CH3]- m/z 690,5025, cho thấy sự hình
thành các ion mang điện tích âm. Trên MS2- của ion âm [M-CH3]- [C37H73NO8P]- cĩ
m/z 690,5025 đã xác định được hai anion của hai axit béo là axit 14:0 ở tín hiệu
mảnh m/z 227,2042 [C14H27O2]- (phần mềm tính m/z 227,2089, sai số 0,0047) (hình 4.5e) và axit 16:0 tại tín hiệu mảnh m/z 255,2262 [C16H31O2]- (phần mềm tính 255,2202, sai số 0,0060) (hình 4.5d). Do đĩ, PC 30:0 được xác định là diacyl glycerophosphocholine, 14:0/16:0.
Bằng cách tương tự như vậy, chúng tơi đã xác định được các dạng phân tử cịn lại của PC trong bảng 4.9 (xem mục 3.4.2.3).
Hình 4.5. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PC 30:0 [C38H76NO8P]
(a) Sắc kí đồ HPLC của [C38H76NO8P], (b) Phổ khối (MS+) của [C38H77NO8P]+, (c) Phổ khối (MS-) tại m/z 690,5025 [C37H73NO8P]-,
4.2.1.4. Xác định các dạng phân tử phosphatidylinositol
Dạng cơng thức cấu tạo phosphatidylinositol (PI):
Từ phổ HRMS, các dạng phân tử PI của lồi rong biển Lobophora sp. đều cho thấy sự hình thành của các ion mang điện tích âm [M-H]-. Ngồi ra, sự phân mảnh MS2- của các ion [M-H]- cũng cho thấy sự hiện diện của một số ion đặc trưng.
Ví dụ, PI 34:1 cĩ hàm lượng cao nhất 44,09% (bảng 4.11).
Trên phổ ion [M-H]- (hình 4.6 a,b) cĩ tín hiệu mạnh nhất tại giá trị m/z